Cultivo primario a partir de cotiledón caprino: un modelo potencial para estudios de trofoblasto

Abstract

El trofoblasto es un tejido epitelial fetal en contacto íntimo con el útero materno, clave en la implantación y mantenimiento de la gestación. El estudio de este tejido mediante modelos in vitro puede contribuir a una mejor comprensión de los mecanismos reproductivos normales, así como de los efectos de agentes patógenos asociados a fallas reproductivas. Entre ellos, Neospora caninum ha sido señalado como una de las principales causas de aborto en bovinos y otras especies domésticas, incluidos los pequeños rumiantes. El establecimiento de cultivos primarios trofoblásticos constituye, en este marco, un recurso potencialmente útil para futuros estudios de infección experimental. El objetivo de este estudio fue caracterizar la celularidad de cultivos primarios de cotiledón caprino, comparando sus rasgos citomorfológicos y la expresión de marcadores epiteliales con los observados en el tejido de origen. A partir de cotiledones de dos placentas de cabra se obtuvieron cultivos primarios mediante la técnica de explante. Los cultivos se repicaron en portaobjetos sembrando 1x10 6 células por cultivo primario. Tras alcanzar la confluencia (48 h), se fijaron durante 40 min con acetona fría (-20°C), se montaron en portaobjetos y se secaron en estufa 1 h. De la misma manera se realizó el cultivo de células L929 (fibroblastos de subcutáneo murino) para utilizar como control negativo de la técnica. En paralelo, otros cotiledones se procesaron mediante la técnica histológica de rutina para su inclusión en parafina y obtención de cortes de 3 µm. Tanto los vidrios obtenidos de los cultivos como los cortes histológicos se destinaron a la técnica de inmunocitoquímica e inmunohistoquímica indirecta, respectivamente, con anticuerpos primarios anti-citoqueratina (policlonal conejo, amplio espectro, [1/200], Dako®) y ant-citoqueratina 7 (monoclonal ratón, [1/100], Dako®) y el sistema ImmunoDetector Biotin Link (anti-ratón/conejo, Bio SB). Como cromógeno se utilizó 3,3- tetrahidrocloruro de diaminobencidina (Kit de sustrato DAB- Peroxidasa HRP, Vector Laboratories®). Por último, el contraste se realizó con hematoxilina de Gill (Biopack). En los cultivos se observaron células de tamaño relativamente grande (aproximadamente 20µm), con citoplasma abundante y núcleos esféricos y laxos, en algunos casos binucleadas, características compatibles con células trofoblásticas. La inmunomarcación para pancitoqueratina fue positiva tanto en el trofoblasto del tejido cotiledonario como en las células cultivadas, mientras que la citoqueratina 7 mostró positividad variable; los fibroblastos control resultaron negativos para ambos marcadores. Estos resultados sugieren que el cultivo está compuesto por células trofoblásticas. La disponibilidad de este cultivo primario ofrece una herramienta que podría facilitar futuros estudios sobre la interacción del trofoblasto con patógenos reproductivos, como Neospora caninum.