Estudio de la apoptosis en cultivos celulares infectados con el virus de la arteritis equina

Abstract

La arteritis viral equina es una enfermedad viral muy importante económicamente en la industria equina cuya prevalencia continúa en aumento, posiblemente debido a la intensificación del transporte de caballos y semen congelado. Es una de las principales causas de aborto, neumoenteritis fulminante en recién nacidos y enfermedad respiratoria alrededor del mundo, donde el macho infectado puede convertirse en portador y transmisor del virus durante el servicio. El virus pertenece a la familia Arteriviridae, es envuelto, posee ARN de simple cadena y contiene numerosas proteínas. Las principales proteínas virales, en cuanto a su abundancia y antigenicidad, son la N (de la nucleocápside) y las proteínas gP5 y M (de membrana). El proceso de apoptosis se encuentra estrictamente controlado a nivel genético y diversos factores pueden alterar el proceso de manera de inducir o inhibir esta respuesta celular. Si bien hay estudios que muestran que este virus induce apoptosis en cultivos celulares identificando distintas enzimas participantes, no se conoce cuál o cuáles proteínas virales estarían involucradas en este proceso. El objetivo general de este trabajo es estudiar la inducción de la apoptosis en cultivos celulares tras la infección con el virus. Se estudiaron diferentes mecanismos moleculares implicados en este proceso mediante el empleo de distintas cepas virales de variada patogenicidad a través de la expresión diferencial de proteínas virales en cultivos. Como primer paso se utilizó el virión completo de las tres cepas virales seleccionadas (Bucyrus, LP-01 y GLD-LP-ARG) y se infectaron 3 líneas celulares (RK-13, Vero y BHK-21), incluyendo controles positivos y negativos. Luego se realizaron construcciones en pCDNA3.1(+) para cada uno de los genes correspondientes a las proteínas M, N y gP5 del VAE y se transfectaron cultivos celulares. Además se evaluó la vía del retículo, representada por la caspasa -12, utilizando distintos inhibidores en células RK-13. Se utilizaron tanto métodos cualitativos como cuantitativos. Nuestros resultados indican que la magnitud de apoptosis observada en los cultivos celulares infectados está directamente relacionada con la patogenicidad y la MOI de la cepa viral del VAE y el tiempo posinoculación. Se observó además que todas las construcciones recombinantes inducen un grado variable de apoptosis, siempre menor a la observada con el virión completo pero mayor respecto a los cultivos que expresan el vector vacío. Además, mediante la utilización de staurosporina, reconocido inductor de apoptosis, observamos un efecto antiapoptótico en las construcciones portadoras de la proteína M, mientras que, por el contrario, se observó un efecto sinérgico en aquellas que contenían los genes de las proteínas gP5 y N del VAE. Por último evidenciamos que la vía del retículo, representada por la caspasa 12, es una de las principales rutas apoptóticas activadas por el VAE. La participación en la muerte celular de los distintos genes virales evaluados, abre nuevos interrogantes que estarían destinados a comprender en mayor profundidad la patogenia de enfermedad, con la esperanza de potenciar y perfeccionar las herramientas de prevención, diagnósticas y terapéuticas disponibles actualmente, mediante la puesta a punto de otras herramientas de detección de la actividad viral en la célula huésped.

Equine viral arteritis is a highly important viral disease economically in the equine industry whose prevalence continues to increase, possibly due to the intensification of the transport of horses and frozen semen. It is one of the main causes of abortion, fulminating pneumoenteritis in newborns and respiratory disease around the world, where the infected male can become a carrier and transmitter of virus during the service. The virus belongs to the family Arteriviridae, is enveloped, has simple chain RNA and contains numerous proteins. The main viral proteins, in terms of their abundance and antigenicity, are N (nucleocapsid) and proteins gP5 and M (membrane). The process of apoptosis is strictly controlled at the genetic level and various factors can alter the process in order to induce or inhibit this cellular response. Although there are studies that show that this virus induces apoptosis in cell cultures by identifying different participating enzymes, it is not known which viral proteins or proteins would be involved in this process. The general objective of this work is to study the induction of apoptosis in cell cultures after infection with EAV. Different molecular mechanisms involved in this process were studied through the use of different strains of EAV through the differential expression of viral proteins in cultures. As a first step, the complete virion of the three selected viral strains (Bucyrus, LP-01 and GLD-LP-ARG) was used and 3 cell lines were infected (RK-13, Vero and BHK-21), including positive and negative controls. Constructs were then made in pCDNA3.1 (+) for each of the genes corresponding to the M, N and gP5 proteins of the VAE and cell cultures were transfected. In addition, the reticulum pathway, represented by caspase -12, was evaluated using different inhibitors in RK-13 cells. Both qualitative and quantitative methods were used. Our results indicate that the magnitude of apoptosis observed in the infected cell cultures is directly related to the pathogenicity and the MOI of the viral strain of the EAV and the posinoculation time. It was also observed that all the recombinant constructs induce a variable degree of apoptosis, always lower than that observed with the complete virion but greater than the cultures that express the empty vector. Furthermore, through the use of staurosporine, a recognized inducer of apoptosis, we observed an antiapoptotic effect in the M protein carrier constructions, whereas, on the contrary, it was observed a synergistic effect in those that contained the genes of the VAE gP5 and N proteins. Finally, we show that the reticulum pathway, represented by caspase 12, is one of the main apoptotic pathways activated by the VAE. The participation in the cell death of the different viral genes evaluated, opens new questions that would be destined to understand in greater depth the pathogenesis of disease, with the hope of strengthening and perfecting the prevention, diagnostic and therapeutic tools currently available, by putting to the point of other tools for detecting viral activity in the host cell.