Caracterización molecular de aislamientos de <i>Cryptosporidium</i> spp. de cerdos en Argentina

Abstract

Cryptosporidium spp., protozoos parásitos de distribución mundial, afectan a una amplia variedad de hospedadores vertebrados incluido el hombre, ocasionando importantes brotes transmitidos generalmente por el agua y causando desde infecciones asintomáticas hasta severos cuadros intestinales. La cryptosporidiosis en cerdos es causada por diferentes especies o genotipos de Cryptosporidium, sin embargo, C. suis y C. scrofarum son consideradas como las especies específicas de los porcinos. Cryptosporidium suis, ha sido identificada en todas las edades/categorías, siendo más frecuente en lechones lactantes, mientras que C. scrofarum aparenta ser específico de los lechones destetados, mayores a 4 semanas de vida. Ambas especies han sido reportadas también en infecciones en humanos. Actualmente la información acerca de la infección por Cryptosporidium spp. en cerdos en Sudamérica es muy escasa. En este trabajo el muestreo se llevó a cabo en 13 granjas porcinas de manejo intensivo, distribuidas en la zona de cría más relevante del país. Un total de 520 muestras individuales (n= 40 por granja) fueron obtenidas de lechones de 1er, 2da, 3er y 4ta semana de edad (n= 130 de cada semana). El diagnóstico de Cryptosporidium spp. se realizó mediante microscopía óptica y por técnicas moleculares. La genotipificación de las muestras con estructuras compatibles con ooquistes de Cryptosporidium spp. se realizó siguiendo protocolos de nested-PCR género-específica y especie-específica que tienen como target fragmentos del gen 18S ARNr y por secuenciación. Se encontraron Cryptosporidium spp. en 47/520 (9%) muestras de materia fecal por microscopía óptica, y fueron detectadas en 11/13 (85%) granjas, con una prevalencia entre 0 y 17,5%. La identificación de ooquistes de Cryptosporidium spp. se asoció con la presencia de diarrea (p=0,0116 /OR=2,62; IC= 1,22-2,62) y con la partición de tipo reja (p= 0,0018 /OR= 3,23; IC= 1,50-3,23) en los corrales del sector maternidad. El resto de las variables analizadas no presentaron asociación con el resultado positivo a la microscopía (p>0,05). En el sector de recría ninguna variable presentó asociación al diagnóstico positivo. La proporción de muestras positivas al microscopio no estuvo asociada con la edad en semanas de los lechones. Un total de 15/47 (32% de las muestras con estructuras compatibles con ooquistes) resultaron positivas por la nested-PCR género y especie-específica. La PCR especie-específica, así como la secuenciación mostraron la presencia de C. suis, C. scrofarum y ambas especies en 3, 8 y 4 muestras de materia fecal, respectivamente. La proporción de muestras positivas para cada PCR específica fue similar entre las edades de los lechones, siendo la proporción de C. suis ligeramente más alta en lechones de cuarta semana. La prevalencia obtenida por medio de la coloración y microscopía fue baja a moderada y ampliamente distribuida en la zona principal de cría de cerdos en Argentina. El uso de herramientas moleculares permitió confirmar la presencia de C. suis y C. scrofarum en cerdos de Argentina, ambas con potencial zoonótico, por lo que deberían considerarse la eliminación apropiada de los residuos fecales para evitar la contaminación ambiental.

Cryptosporidium spp. are protozoan parasites with a worldwide distribution infecting a wide variety of vertebrate hosts including humans, producing important water-borne outbreaks and causing from asymptomatic infections to severe intestinal symptoms. Cryptosporidiosis in pigs is caused by different Cryptosporidium species or genotypes, however C. suis and C. scrofarum are considered as the porcine specific species. Cryptosporidium suis infects all age categories, being detected more frequently in pigs younger than 5 weeks-old, whereas C. scrofarum appears to be specific for post weaning piglets, older than 4 weeks of age. Currently, there is scarce information on Cryptosporidium spp. infection in pigs in South America. In this work, the sampling was carried out in 13 intensively managed pig farms, distributed in the most relevant breeding area of the country. A total of 520 individual fecal samples were obtained from piglets of 1st, 2nd, 3th and 4th week of age. Cryptosporidium spp. diagnosis was conducted by microscopy and molecular techniques. Genotyping from samples with Cryptosporidium-like oocysts at microscopy was performed by genus-specific and species-specific nested-PCR protocols targeting 18S rRNA gene fragments and sequencing. Cryptosporidium spp. were found in 47/520 (9%) fecal samples by microscopy and it was detected in 11/13 (85%) farms, with a farm prevalence between 0 and 17.5%. The presence of Cryptosporidium oocyst was associated with diarrhea (p=0,0116 /OR=2,62; IC= 1,22-2,62) and grill partition (p= 0,0018 /OR= 3,23; IC= 1,50-3,23) in the nursery. The rest of the variables analyzed did not show an association with the positive microscopy result (p>0,05). In the sector of recently weaned piglets, no variable was associated with a positive diagnosis. The proportion of microscopy positive samples was not associated with the piglets’ ages. A total of 15/47 (32% of samples with oocysts compatible structures) resulted positive by genus and species-specific nested PCRs. Species-specific PCR and sequencing showed the presence of C. suis, C. scrofarum and both species in 3, 8 and 4 samples, respectively. The proportion of positive samples on each specific PCR was similar among piglets’ ages, being C. suis proportion slightly higher in fourth-week piglets. The prevalence obtained by staining and microscopy was low to moderate and was widely distributed in the main pig husbandry area from Argentina. The use of molecular tools allowed the confirmation of C. suis and C. scrofarum infection in Argentinean pigs, both with zoonotic potential, for which the appropriate disposal of fecal waste should be considered to avoid environmental contamination.