Reprogramación celular y rejuvenecimiento: aplicación en el cerebro senil

Abstract

El envejecimiento es un proceso asociado a un progresivo deterioro del aprendizaje y la memoria espacial y de reconocimiento, ocasionado por cambios morfológicos y moleculares en el cerebro, particularmente en el hipocampo – estructura clave en la formación y consolidación de la memoria – y en la corteza perirrinal. La rata senil presenta cambios similares al humano senil en la morfometría de su hipocampo y, además, tiene un desempeño inferior al de la rata joven en pruebas de memoria, lo cual la convierte en un excelente modelo de investigación básica para desarrollar terapias novedosas contra el deterioro cognitivo asociado a la edad. En este contexto surge la implementación de la reprogramación celular mediada por factores de pluripotencia como estrategia terapéutica. Se ha demostrado que la reprogramación celular puede revertir el fenotipo envejecido, logrando un rejuvenecimiento a nivel celular y epigenético. Así, se propuso como principal objetivo de esta tesis la implementación de una terapia que nos permita revertir los cambios degenerativos que ocurren en el cerebro con el envejecimiento. Para ello, desarrollamos en nuestro laboratorio un vector adenoviral portador de 4 genes de pluripotencia, específicamente oct4, sox2, klf4 y c-myc (OSKM), y del gen de la GFP (green fluorescent protein). Este vector fue caracterizado para su posterior uso en estudios de rejuvenecimiento por reprogramación parcial. Se llevó a cabo un protocolo de sobreexpresión de los genes de pluripotencia en fibroblastos de rata senil durante tres días, logrando revertir el fenotipo de uno de tres marcadores epigenéticos evaluados. Posteriormente se caracterizó el modelo biológico utilizado en el laboratorio, la rata hembra Sprague-Dawley, tomando el hipocampo y la corteza perirrinal como las principales zonas de interés. Se llevaron a cabo pruebas cognitivas y se estudiaron varias poblaciones celulares a fin de evaluar si existía alguna relación entre los cambios cognitivos y los cambios morfológicos observados con la edad. Se llegó a la conclusión de que, si bien ambos nodos son de importancia para la memoria espacial y de reconocimiento, el hipocampo es más vulnerable que la corteza perirrinal y presenta una disfunción más temprana, de modo que se lo escogió como blanco para realizar terapia génica con los genes OSKM. Por otro lado, nos propusimos poner a punto un reloj epigenético apto para aplicar en rata, dado que hasta el momento sólo existían relojes de humano y de ratón. Los relojes epigenéticos son biomarcadores de edad muy exactos, que miden la edad biológica del individuo analizando la metilación de un set de CpGs (dinucleótidos citosina-guanina). Esto se llevó a cabo con éxito, en colaboración con el grupo del Dr. Stephen Horvath de la Universidad de California, Estados Unidos. El reloj desarrollado nos permitió demostrar que los cambios asociados a la edad en la metilación de ciertas CpGs se correlacionan con el deterioro en la memoria de los animales. En base a estos resultados procedimos a implementar la terapia génica in vivo en el hipocampo de ratas seniles inyectando el adenovector con los genes OSKM. La sobreexpresión de los genes durante 49 días no generó un aumento en la mortalidad de los animales. No se observaron efectos de la terapia sobre la memoria de reconocimiento ni la memoria espacial, pero sí se observó una mejora en el aprendizaje de las ratas. Se estudió también la neurogénesis y las conexiones sinápticas en los cerebros de los animales tratados, aunque no se observaron diferencias significativas en comparación con los animales control, de modo que no fue posible correlacionar la mejora cognitiva con estos parámetros. A su vez, se midió la edad biológica de las muestras, pero sólo se observó diferencia entre las muestras provenientes de ratas jóvenes y las provenientes de ratas seniles (tanto tratadas como control). Como último objetivo de este trabajo de tesis, se buscó poner a punto un método de criopreservación de los cerebros a fin de optimizar su conservación para que en futuros trabajos se puedan estudiar las distintas poblaciones celulares y/o las conexiones entre las neuronas minimizando las variaciones que pueden aumentar el error experimental. El presente trabajo de tesis doctoral es pionero en el estudio de rejuvenecimiento in vivo en hipocampo de rata envejecida y en los efectos de la terapia implementada a nivel cognitivo, resultando de gran relevancia para el campo de la neurociencia.