Obtención de vesículas extracelulares a partir de sobrenadantes de fibroblastos asociados a cáncer de mama estimulados con componentes nutricionales de patrones dietarios de Córdoba

Abstract

Numerosas evidencias señalan una fuerte asociación entre componentes nutricionales y el desarrollo y mantenimiento de procesos tumorales. En Córdoba, se describió que la mayor adherencia a patrones dietarios (PD) provistos por alimentos ricos en carbohidratos y ácidos grasos saturados, representados principalmente por fructosa (F) y ácido palmítico (AP) respectivamente, se encuentra asociado de manera positiva al riesgo de cáncer colorrectal y de mama. Sin embargo, no se conocen completamente los mecanismos celulares por los cuales estos componentes promoverían mayor agresividad tumoral. La forma de comunicación intercelular mediada por vesículas extracelulares (EVs) ha cobrado relevancia recientemente debido a la amplitud de funciones que pueden desempeñar. Estas estructuras se pueden clasificar según su tamaño por microscopía electrónica de transmisión (MET) e inmunocitoquímica ultraestructural en: exosomas (30-100 nm) y microvesículas (100-1000 nm). Es importante señalar que las EVs liberadas, tanto por las células tumorales como del entorno, pueden ser reguladas por ácidos grasos presentes en los PD agravando, por ejemplo, el proceso de transición epitelio-mesenquimal en cáncer de mama. Nuestro objetivo fue evaluar in vitro el rol de los componentes dietarios (F y AP) en la liberación de EVs por parte de fibroblastos asociados al cáncer (CAFs). Para ello, células CAFs de la línea F88 de adenoma mamario humano fueron cultivadas en medio DMEM con 10% SFB y estimuladas con F 40 mM, AP 250 uM, combinaciones de ambos (F+AP) o con vehículo, por 24 horas (concentraciones características de PD de Córdoba). Posteriormente, se colectaron sobrenadantes y se aislaron EVs a través de centrifugaciones y ultracentrifugaciones secuenciales (2k, 10k y 100k). Las EVs fueron observadas por MET con tinción negativa para su caracterización (tamaño y forma) y evaluadas para marcador de EVs CD63 mediante inmunomarcación con oro coloidal. Células tumorales epiteliales de mama de la línea MCF-7 fueron cultivadas en medio DMEM con 10% SFB y posteriormente estimuladas con los medios condicionados provenientes de las células F88 por 24 horas. Los estímulos aislados no provocaron cambios estadísticamente significativos en la liberación de EVs, aunque la combinación F+AP sí indujo un mayor incremento en el número de EVs obtenidas al ser observadas por MET. Tampoco hubo diferencias significativas entre F y AP de manera individual. Se pudo observar la forma cóncava, característica principal de los exosomas. El mayor número de EVs se encontró en el rango de 20-30 nm de tamaño, sin que los tratamientos alteraran significativamente este rango. Por otro lado, las células MCF7 al ser estimuladas con medios condicionados tratados con F+AP mostraron un incremento en la proliferación celular (ANOVA, p<0,05), determinada mediante incorporación de bromodeoxiuridina y conteo celular. La combinación F+AP sí indujo un fuerte cambio fenotípico, con mayor desarrollo de organelas proteinopoiéticas y secretorias al ser analizadas por MET. Estos resultados podrían sugerir un efecto patogénico de alimentos ricos en F y AP sobre el cáncer de mama, mediante el aumento en la proliferación celular y la liberación de EVs por parte de CAFs.