Caracterización de organoides intestinales humanos para el estudio de las células epiteliales en homeostasis e inflamación

Abstract

Las células epiteliales intestinales (CEI) constituyen una población heterogénea y dinámica que, junto con otras células del sistema inmune, conforman el compartimiento epitelial. Los distintos tipos de CEI maduras, originados a partir de células madre intestinales (CMI), poseen funciones fisiológicas específicas y, en conjunto, desempeñan un papel crucial en el monitoreo y regulación de la microbiota, así como en la iniciación y modulación de la respuesta inmune en el tejido subyacente. Diversas patologías inflamatorias intestinales se originan por alteraciones en este compartimiento. El estudio de las CEI humanas se ha visto históricamente limitado por la dificultad para establecer cultivos primarios, debido a que estas células entran en apoptosis al ser desprendidas de su matriz extracelular. Nuestro grupo ha trabajado en el desarrollo de estrategias para superar este obstáculo 1, y en los últimos años, los cultivos tridimensionales (organoides) han adquirido gran relevancia, dado que permiten mantener en cultivo, entre otras poblaciones celulares, a las CEI humanas y murinas, preservando al mismo tiempo su información genética. Estos cultivos resultan significativamente más representativos y robustos que los modelos animales o líneas celulares transformadas. En esta Tesis Doctoral, desarrollamos cultivos de organoides a partir de CEI obtenidas de pacientes con diferentes tipos de inflamación intestinal, de distintas regiones del intestino y de diversos rangos etarios. Optimizamos técnicas para su caracterización e identificamos, mediante microscopía confocal y PCR en tiempo real, marcadores epiteliales y alarminas típicamente por las CEI. Además, para estudiar el comportamiento epitelial en un contexto de inflamación tipo 2, realizamos un análisis transcriptómico de CEI aisladas de pólipos juveniles (PJ) de pacientes pediátricos con sangrado rectal y sospecha de alergia alimentaria. Estos pólipos, previamente caracterizados por nuestro grupo, presentan un marcado infiltrado eosinofílico y presencia de centros germinales activos con niveles elevados de IgE local, en contraste con el tejido normal circundante. Si bien la mayoría de los pacientes no presenta sintomatología al momento del diagnóstico, muchos de ellos poseen antecedentes personales y/o familiares de alergia o atopía, así como niveles elevados de IgE total y específica en sangre2–4. Dado que estos pacientes presentan niveles aumentados de IgE sérica pero no desarrollan sintomatología frente a la exposición a alergenos, se los denomina “pacientes sensibilizados o tolerantes”. El análisis de RNA-seq reveló una sobreexpresión de múltiples genes asociados a inflamación tipo 2 en CEI derivadas de PJ en comparación con el tejido circundante control (TCP), incluyendo IL33, CHI3L1, CCL22, CCL24, SERPINB3, SERPINB4, entre otros. Asimismo, el análisis de enriquecimiento funcional mostró en este grupo una activación de vías relacionadas con la inflamación tipo 2, la respuesta a estímulos externos, la quimiotaxis de granulocitos y reprogramación metabólica. Sorprendentemente, también detectamos la sobreexpresión de genes asociados a cáncer colorrectal (CCR), como SERPINE1, junto con la activación de rutas vinculadas a remodelación de la matriz extracelular, angiogénesis y cambios en el metabolismo energético celular. Si bien la relación entre AA y CCR no está descripta, se ha establecido que algunos tipos de inflamación crónica, como la observada en enfermedades inflamatorias intestinales o inflamación de bajo grado, pueden favorecer el desarrollo de procesos oncogénicos. En conjunto, los resultados de esta Tesis Doctoral aportan información y un procedimiento técnico para el establecimiento de un sistema robusto de cultivo primario de CEI, que permitirá profundizar en el estudio de su biología y comprender su comportamiento en contextos de inflamación mucosal tipo 2.