Producción de la toxina Épsilon recombinante de Clostridium perfringens como alternativa de inmunógeno vacunal

Abstract

La proteína epsilon (ETX) es una toxina formadora de poros producida por los toxinotipos B y D de Clostridium perfringens. Se sintetiza inicialmente en forma de protoxina con baja toxicidad y se activa mediante clivaje proteolítico en el intestino, causando enterotoxemia, una enfermedad mortal que afecta principalmente a rumiantes. Por esta razón, la inmunoprofilaxis es el único método eficaz de prevención para evitar las pérdidas económicas. En la actualidad, las vacunas disponibles formuladas como anavacunas, presentan una cantidad excesiva de componentes no específicos que pueden interferir con la respuesta inmune y aumentar el riesgo de accidentes vacunales. Además, la manipulación del microorganismo y la toxina per se implica un alto riesgo biológico, por lo que su producción recombinante sería una alternativa para su uso como inmunógeno. En este contexto, el sistema de expresión en Pichia pastoris es prometedor por su procesamiento postraduccional similar al de eucariotas superiores, un promotor inducible por metanol y la capacidad de secretar proteínas al medio extracelular. El objetivo fue obtener y caracterizar la proteína ETX recombinante en P. pastoris. Para ello, se desarrollaron dos versiones: una truncada (rETX) y una versión mutada (rETXH106P). Se clonaron y expresaron clones recombinantes de P. pastoris, en los vectores pGEM-T y pPIC9, respectivamente. Estos clones fueron posteriormente utilizados para realizar ensayos de expresión a baja escala. Una vez obtenida la expresión de la proteína recombinante en el sistema heterólogo, se evaluó la 5 citotoxicidad in vitro de las variantes recombinantes obtenidas en cultivos de baja escala, utilizando células MDCK. Estas variantes se compararon con diferentes diluciones de la toxina wild type (ETXwt). Para los ensayos a gran escala se realizaron cultivos en batch y fed-batch utilizando un clon de P. pastoris que expresaba rETXH106P. Se determinó el rendimiento de biomasa (Y x/s) y la velocidad de crecimiento (μ máx.) con glicerol y metanol, en ambas instancias de batch. El sobrenadante de cultivo se concentró mediante ultrafiltración tangencial (UFT) y se purificó en un ensayo de cromatografía de intercambio iónico. Se confirmó la presencia de la proteína recombinante por SDS-PAGE y Western blot, observándose una banda de 31 KDa. A partir de los sobrenadantes concentrados y purificados se realizó un ensayo de inmunogenicidad in vivo, utilizando rETXH106P como inoculo experimental. La formulación evaluada no logró conferir protección frente al desafío con ETX wild type, observándose mortalidad en los animales inmunizados comparable a la de los controles. Estos resultados indican que, bajo las condiciones ensayadas, rETXH106P no fue capaz de inducir una respuesta inmune protectora efectiva. Por lo tanto, futuros ensayos serán necesarios para confirmar la capacidad protectiva de las proteínas recombinantes.