Desarrollo de una nueva terapia para el tratamiento de lesiones ulcerosas crónicas mediante el trasplante alogénico de una subpoblación de células madre mesenquimales derivadas de cordones umbilicales humanos

Abstract

Las lesiones cutáneas ulcerosas crónicas constituyen un problema clínico de alta relevancia, debido a su elevada prevalencia, recurrencia y al impacto significativo que generan en la calidad de vida de los pacientes. Estas lesiones pueden asociarse a diversas etiologías, pero comparten un denominador común: la incapacidad del tejido afectado para completar adecuadamente el proceso fisiológico de cicatrización. Desde el punto de vista fisiopatológico, se desarrollan en un microambiente tisular adverso, caracterizado por inflamación persistente, activación endotelial sostenida, hipoxia, estrés oxidativo, liberación excesiva de proteasas, degradación de la matriz extracelular y disfunción de fibroblastos y queratinocitos. Como consecuencia, el proceso normal de reparación se interrumpe, con alteraciones en la reepitelización, angiogénesis insuficiente y una remodelación tisular desorganizada. A pesar de los avances terapéuticos, un porcentaje significativo de estas lesiones no responde adecuadamente a los tratamientos convencionales. Esto pone de manifiesto la necesidad de desarrollar abordajes terapéuticos innovadores capaces de actuar sobre los mecanismos celulares y moleculares subyacentes. En este contexto, la terapia celular basada en células madre mesenquimales (CMM) ha emergido como una estrategia prometedora dentro del campo de la medicina regenerativa. Las CMM han sido ampliamente estudiadas por su capacidad de autorrenovación y diferenciación, y de su actividad inmunomoduladora. Más allá de su potencial de diferenciación, actualmente se reconoce que sus efectos terapéuticos se ejercen también a través de mecanismos paracrinos, mediante la secreción de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y vesículas extracelulares (VE) capaces de modular el microambiente tisular dañado. A través de estos mecanismos, las CMM estimulan la angiogénesis, inhiben la proliferación de linfocitos T y promueven la expansión de células T regulatorias. Asimismo, contribuyen a la activación de fibroblastos y queratinocitos, facilitando la reepitelización y la adecuada remodelación de la matriz extracelular. Dentro de las distintas fuentes de CMM, las derivadas de cordón umbilical (CMMcu) presentan ventajas biológicas y de aplicación particularmente relevantes frente a las obtenidas de médula ósea o tejido adiposo. Las CMMcu exhiben mayor capacidad proliferativa y menor inmunogenicidad. Además, su perfil secretor se caracteriza por una elevada producción de factores pro-angiogénicos e inmunomoduladores, potenciando su acción en entornos inflamatorios crónicos como las lesiones ulcerosas. A ello se suma la facilidad para su obtención a partir de un tejido habitualmente descartado tras el nacimiento, mediante un procedimiento no invasivo. Estas características posicionan a las CMMcu como una fuente celular especialmente adecuada para el desarrollo de una nueva terapia celular. En este contexto, se planteó como objetivo general de esta tesis doctoral desarrollar una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de lesiones cutáneas ulcerosas crónicas mediante la aplicación alogénica de una subpoblación específica de CMMcu, denominada células mesenquimales derivadas (CMD), seleccionada en función de su perfil inmunomodulador y pro-regenerativo. Para esto, se evaluó la expresión de HLA-G y VEGF-A en el tejido mesenquimático de la gelatina de Wharton, confirmándose marcación positiva en todos los cordones umbilicales analizados. Posteriormente, se aislaron, expandieron y caracterizaron las CMMcu. Su caracterización reveló una alta expresión de biomoléculas asociadas a tolerancia inmunológica y regeneración tisular, incluyendo PD-L1, FOXP3, LAG3, TNFR2, VEGF-A, NRP-1, NCAM y CLU, así como una expresión intermedia de CTLA-4 e IDO. Asimismo, se identificaron diferentes isoformas de HLA-G, incluyendo la detección de la variante HLA-GΔα1, constituyendo el primer reporte de su expresión en CMMcu, un hallazgo original de este trabajo. A partir de estos resultados, se definió la subpoblación de CMD según criterios específicos: expresión positiva de marcadores de CMM; expresión funcional de HLA-G y VEGF-A; ausencia de marcadores hematopoyéticos; y ausencia de HLA-DR. Esta estrategia permitió seleccionar una población homogénea con alto potencial inmunomodulador y menor riesgo de rechazo alogénico. La capacidad inmunomoduladora de las CMD fue confirmada ex vivo mediante ensayos de inhibición de proliferación linfocitaria. Estos hallazgos fueron respaldados en un modelo murino de lesión dérmica, en el cual se estableció una dosis óptima de 250.000 CMD para su aplicación local. Se demostró que el tratamiento con CMD aceleró de manera significativa el cierre de las heridas y mejoró la calidad del tejido neoformado respecto del control. En esquemas de administración repetida, el tratamiento con las CMD (HLA-G+) mostraron una respuesta inflamatoria significativamente más controlada en comparación con las CMMcu (HLA-G -), lo que refuerza el rol del HLA-G en la inducción de tolerancia inmunitaria. Con el objetivo de desarrollar una herramienta para estudios in vivo de la biodistribución de las células trasplantadas, se generó una línea estable CMD-EGFP/Luc mediante transducción lentiviral. De manera complementaria, se avanzó hacia la validación traslacional de la estrategia mediante el desarrollo de un modelo preclínico en equinos, orientado a evaluar la seguridad y eficacia del trasplante alogénico de CMMcu. Para esto, se procedió al aislamiento y expansión de CMMcu equinas (eqMC). Estas fueron caracterizadas por citometría de flujo. Asimismo, se identificó en estas células un homólogo equino del HLA-G, hallazgo particularmente relevante que podría contribuir a explicar la tolerancia inmunológica observada tras el trasplante alogénico. Desde el punto de vista funcional, las eqMC demostraron una marcada capacidad inmunomoduladora ex vivo, evidenciada por la inhibición de la proliferación linfocitaria. En un modelo murino de xenotrasplante, la administración local de eqMC aceleró significativamente el cierre de las heridas y la recuperación de la pilosidad en comparación con los controles, con resultados similares a los observados con las CMD. Finalmente, se realizó un ensayo en equinos con lesiones severas en los miembros. El tratamiento alogénico de las lesiones mediante inyección de eqMC fue bien tolerado, incluso tras dosis repetidas, sin alteraciones clínicas ni hematológicas compatibles con rechazo. Luego del tratamiento con eqMC se observó una reducción en los tiempos de cicatrización, ausencia de hiperqueratosis y una dermis con fibras colágenas mejor empaquetadas. Estos resultados sugieren no solo aceleración del proceso de cicatrización, sino también mejora en la calidad del tejido neoformado, aspecto crítico para prevenir fibrosis exuberante. En conjunto, los resultados obtenidos en el desarrollo de esta tesis demuestran que la selección de una subpoblación específica de CMMcu (CMD) basada en biomarcadores funcionales permite optimizar la eficacia y seguridad de la terapia alogénica en lesiones cutáneas crónicas. La combinación de un perfil inmunomodulador robusto, capacidad regenerativa, validación en modelos murinos y confirmación clínica en equinos posiciona a las CMD y a las eqMC como terapias celulares con alto potencial en el área de la medicina regenerativa. Estos hallazgos aportan evidencia sólida para el desarrollo de terapias celulares estandarizadas orientadas a mejorar la regeneración tisular en lesiones cutáneas crónicas tanto en medicina veterinaria como humana.