Evaluación del daño fotoinducido por sensibilizadores lipofílicos e hidrosolubles en proteoliposomas de DOPC y DOPC:colesterol

Abstract

Muchos compuestos heterocíclicos naturales, como pterinas y flavinas son fotoquímicamente activos y pueden actuar como fotosensibilizadores (Sens), es decir, moléculas que son capaces de absorber radiación en un rango del espectro electromagnético en el cual las biomoléculas no absorben y generar especies excitadas capaces de dañarlas1. El descubrimiento de estos procesos ha generado la necesidad de buscar y estudiar aquellos compuestos que pueden actuar como Sens, con el fin de evitar la exposición a los mismos y entender los mecanismos por los cuales actúan. En los últimos años, se ha demostrado que los Sens lipofílicos son mucho más eficientes para generar daño en membrana que los hidrosolubles debido al contacto directo con la bicapa lipídica2. Por otro lado, el estudio de los procesos fotosensibilizados se ha llevado a cabo principalmente en sistemas homogéneos, los cuales, no necesariamente representan lo que puede estar ocurriendo a nivel celular. En este trabajo se utilizaron como modelo de estudio proteoliposomas (PLs), sistemas constituidos por vesículas unilamelares grandes (LUVs) en cuya membrana se incorporan proteínas que interaccionan con la misma. La proteína empleada fue α-hemolisina (HlyA), exotoxina formadora de poros, secretada por cepas uropatogénicas de E.coli cuya actividad lítica involucra la unión, inserción y oligomerización de la toxina en la membrana de la célula blanco (glóbulos rojos, linfocitos, macrófagos, etc). Como modelo de membrana se emplearon LUVs constituidos por DOPC y DOPC:Chol (2:1) y como Sens, Riboflavina (Rf) y su análogo lipofílico N-decil-Riboflavina (decil-Rf). Con el objetivo de evaluar la capacidad de estos Sens de generar alteraciones fotoinducidas, mezclas de PLs y Sens fueron expuestos a luz azul (445 nm) por diferentes tiempos. Se empleó H4BPMHC, una sonda sensible a especies reactivas de oxígeno (ROS)3 para evaluar el efecto de la composición lipídica y la presencia de la toxina en el proceso fotoinducido adicional a esto se empleó Laurdan como indicador de la fluidez de membrana. Se midió la intensidad de fluorescencia de la sonda en función del tiempo de irradiación y se empleó microscopía de campo amplio.