Genoteca de cDNA normalizada de Rhodnius prolixus

Abstract

El objetivodel presente trabajo es generar una genoteca normalizada de Rhodnius prolixus, enriquecida en fragmentos de cDNA largos, utilizando un método de normalización basado en una nucleasa termoestable (nucleasa específica de ADN de doble cadena del cangrejo de Kamchatka o Kamchatka Crab Duplex-Specific Nuclease, KCDSN, (Zhulidov et al., 2004), y LD-PCR (Long Distance-PCR) de acuerdo al protocolo descripto por Anisimova et al., (2006). El método se basa en la degradación de la fracción ds cDNA mediante el uso de una nucleasa que tiene especificidad por la doble cadena (DSN). Este método involucra la desnaturalización y renaturalización del cDNA, la degradación de la fracción doble cadena de cDNA (dsDNA), por parte de la nucleasa, y la posterior amplificación de la fracción ds cDNA. El proceso de reasociación de cadenas tiene una cinética de primer orden, en la que los trasncriptos más abundantes se asocian más rápidamente que los de menor concentración. Por lo tanto al cabo de un cierto tiempo la nucleasa cortara en mayor proporcion, transcriptos abundantes. Posteriormente, la nucleasa es inactivada y el ADNc no cortado es amplificado en dos ciclos de PCR. La DSN tiene su máxima actividad a una temperatura de entre 60 – 70 °C, y además se caracteriza por tener una mayor afinidad por el ds cDNA y por los híbridos de ARN-ADN, que por el ss cDNA (Zhulidov, 2004).