Filogeografía de <i>Zaedyus pichiy</i> (Mammalia, Xenarthra) y su correlación con el paleoclima del sur de Sudamérica

Abstract

Zaedyus pichiy es un armadillo que pertenece a la Subfamilia Euphractinae junto con las especies de los géneros Chaetophractus y Euphractus. El origen y las relaciones entre las especies actuales de Euphractinae no están resueltos, sin embargo su radiación se relaciona a importantes cambios ambientales provocados por el levantamiento de la cordillera de los Andes. Los registros fósiles para los géneros actuales de la subfamilia se remontan al Mioceno tardío mientras que los registros de sus especies son del plioceno/Pleistoceno. Por otro lado, se cree que la distribución de todos los armadillos actuales ha sido afectada por fluctuaciones climáticas y del nivel del mar, características del Pleistoceno, debidas al avance y retirada de los glaciares que causaron la retracción y expansión de biomas. Zaedyus pichiy presenta la mayor parte de su amplia distribución en Argentina, habiéndose extendido a Chile en el reciente. Como indica el título, este estudio pretende aportar conocimiento sobre la historia filogeográfica de Zaedyus pichiy en Argentina, donde tuvo lugar la mayor parte de su historia evolutiva. Sin embargo la primera pregunta que surge es ¿Dónde y cuándo se originó Zaedyus pichiy?, lo que lleva a interrogantes sobre la historia evolutiva de la subfamilia Euphractinae a la que pertenece, como por ejemplo: ¿Cómo y cuándo fue el origen de las especies actuales de Euphractinae, fue una radiación temprana en el Mioceno tardío-Plioceno temprano en la Región Pampeana?, coincidiendo con los registros más tempranos de sus géneros en ese periodo y región; ¿cómo se relaciona Zaedyus pichiy con el resto de los géneros actuales de Euphractinae? en la actualidad hay dos hipótesis, una plantean que el género Chaetophractus es parafiletico estando C. villosus emparentado con Euphractus, y C. vellerosus siendo especie hermana de Zaedyus pichiy, mientras que en la tradicional, el género Chaetophractus es monofilético, estando agrupado con E. sexcinctus, siendo Z. pichiy el primer linaje en emerger. Y finalmente profundizando sobre Zaedyus pichiy ¿cuál es la diversidad genética de sus poblaciones, como se distribuye en la actualidad y cuál fue la historia de sus poblaciones para llegar a ella, que factores la moldearon?¿Fueron los cambios climáticos cíclicos ocurridos durante el Pleistoceno? de ser asi, la diversidad de los haplotipos de sus poblaciones debería distribuirse en un gradiente latitudinal, los más ancestrales en latitudes más bajas, mientras que los derivados evolutivamente de aquellos en latitudes más altas, mostrando la expansión más reciente debido al aumento de temperatura. Para intentar responder estas preguntas se planteo como objetivos: (1) Esclarecer las relaciones filogenéticas entre las especies actuales de Euphractinae, determinar sus tiempos de divergencia y sus posibles áreas ancestrales. (2) Analizar el patrón filogeográfico de Zaedyus pichiy en todo su rango de distribución en Argentina y examinar la relación entre dicho patrón y la historia geomorfológica de la región. Primero se realizó la caracterización y el análisis de las secuencias obtenidas de una porción de la Región Control (RC) del D-loop, y de una porción del gen de la citocromo c oxidasa subunidad I (COI) del ADN mitocondrial en representantes del Magorden Xenarthra, ahondando en la estructura de las secuencias de D-loop y sus posibles implicancias.Las relaciones filogenéticas de las especies actuales de la subfamilia Euphractinae fueron inicialmente abordadas mediante los métodos tradicionales de inferencias filogenéticas (Parsimonia, Máxima Verosimilitud e Inferencias Bayesianas) analizando una porción del gen COI. Se utilizaron secuencias de este marcador para 16 especímenes pertenecientes a Euphractinae, con varias secuencias para cada unidad taxonómica, como así también 13 secuencias para representantes del resto de las subfamilias de Cingulata y 6 secuencias del clado Pilosa que se utilizaron como outgroup. Obteniendo una matriz de alineamiento final de 35 individuos totales y 658 pb. Además, se estimó el árbol de especies a través del método bayesiano basado en coalescencia que estima filogenia de múltiples marcadores y se realizó una prueba de hipótesis filogenéticas forzando la monofilia entre las diferentes especies, siendo cada hipótesis una combinación diferente entre dos especies actuales de la subfamilia. Para estos análisis se utilizaron 51 secuencias parciales del gen mitocondrial COI con una longitud de 658 pb, obtenidas en este estudio y otras disponibles en bases de datos públicas. También se utilizó 19 secuencias disponibles del gen factor von Willebrand (vwf) con una longitud de 1145 pb y 17 del gen cáncer de mama 1 (BRCA1) de 2851 pb de longitud. Finalmente, utilizando el árbol de especies se intentó aproximar el territorio donde ocurriera esta diversificación, haciendo un análisis de aéreas ancestrales por métodos basados en Parsimonia, Máxima Verosimilitud e Inferencias Bayesianas. Para el estudio integral filogeográfico de Zaedyus pichiy en Argentina se utilizaron las porciones del gen COI y de la Región Control (D-loop). Ya sea analizando la matriz de ambos marcadores concatenados (COI + D-loop) o sus matrices por separado. La matriz obtenida de los marcadores concatenados resulto de 1115 pb de longitud, contando con 112 secuencias de las que 37 son de individuos en los que se logró secuenciar ambos marcadores, 26 cuentan con secuencias para el marcador COI y 49 individuos para D-loop, teniendo una cantidad considerable de datos faltantes. Debido a esto también se utilizó una matriz más chica de marcadores concatenados (COI+D-loop), sin datos faltantes de 28 secuencias y 967 pb. Como así también las matrices de los marcadores por separado reducidas a la mayor cantidad de secuencias y pares de bases con la menor cantidad de datos faltantes posible. Obteniendo para la matriz del marcador COI 59 secuencias de 492 pb de longitud, donde se identificaron 27 haplotipos y donde las diversidades haplotípica y nucleotídica fueron de 0,933 y 0,01420 respectivamente, mientras que para el fragmento D-loop se obtuvo una matriz de 75 secuencias con una longitud de 405 pb y 38 haplotipos con una diversidad haplotípica de 0,957 y nucleotídica de 0,01559. Se analizó la diversidad genética y la estructura poblacional de la especie, como así también se estudió la historia demográfica y se analizó la congruencia entre las estimaciones de los procesos inferidos para la especie con los registros paleontológico y arqueológico y estudios del paleoclima, relacionándolo con sus características de historia de vida, a fin de lograr un mayor entendimiento. En cuanto a la estructura de las secuencias de D-loop: Se encontró un fragmento de 80 pb que se repite en las secuencias de la primera porción de la RC del D-loop en las especies de armadillos estudiados. El motivo de repetición es adyacente a la secuencia del dominio TAS de dicha región y su origen seria causado por undeslizamiento de replicación unidireccional en una dirección de 3' a 5'. La explicación más parsimoniosa para la evolución de las repeticiones en las especies actuales de Euphractinae con implicancias en la filogenia de la subfamilia es que existe una mayor cercanía entre Zaedyus y Chaetophractus, hipótesis que no concuerda con la filogenia clásica de los Euphractinae. La heterogeneidad encontrada en esta subfamilia hace que sea difícil proponer un patrón general de variación en las repeticiones de la RC del D-loop. En cuanto a la filogenia de la subfamilia: Los análisis tradicionales del marcador COI no resolvieron las relaciones dentro de la subfamilia Euphractinae y al combinarlo con los marcadores nucleares en el análisis Bayesiano particionado se sostiene que Zaedyus pichiy es la especie basal de la subfamilia, coincidiendo con la hipótesis tradicional. Sin embargo, el clado Euphractus + Chaetophractus recibe un apoyo moderado. En el análisis de las diferentes hipótesis de delimitación, la hipótesis que agrupa a E. sexcintus con C. villosus es la que presentaría menos ambigüedad. Por lo tanto sigue habiendo discrepancias en los resultados de marcadores codificantes. En este estudio se descarta que las discrepancias se deban a la inclusión de una sola especie del género Chaetophractus o a la tasa evolutiva del marcador utilizado, afirmando como la mayor causa a la reciente y rápida diversificación de la subfamilia. El origen del clado que contiene a las especies actuales de Euphractinae es de 3,60 Ma (95% HPD: 1,75-7,53), siendo un poco más recientes que en estudios anteriores y coincidentes con las estimaciones de las últimas etapas del levantamiento andino y la consiguiente formación de biomas secos en el cono sur, que tuvieron lugar en el Plioceno. Estos acontecimientos también explican la separación entre Zaedyus con Euphractus + Chaetophractus que es de 2,92 Ma (95% HPD: 1,02-6,16). Por su parte, la diferenciación de Chaetophractus en sus especies tiene una edad estimada de 2,42 Ma, que es apoyada por el registro fósil y coincide con el comienzo del Pleistoceno, período que se caracterizó por fluctuaciones del clima hasta que se establecieron los ciclos glaciares. Según los análisis biogeográficos, el origen del clado Euphractinae es el área de los desiertos templados del centro de Argentina. La separación entre sus especies resultaron ser más reciente que la hipótesis propuesta sobre una radiación temprana en el Mioceno tardío-Plioceno temprano en la Región Pampeana, donde comienzan los registros de sus géneros. Los resultados en este trabajo rechazan esa hipótesis y acercan dichos orígenes al establecimiento de las especies actuales en el registro fósil, abarcando el intervalo que va desde Plioceno medio al Pleistoceno y proponiendo como el área de ocurrencia los desiertos templados del centro de Argentina. En cuanto a la Filogeografia de Zaedyus pichiy: Esta especie presenta una cierta y particular estructuración geográfica, pudiéndose identificar dos unidades filogeográficas diferenciadas dentro de su amplio rango de distribución. El clado A aúna casi en su totalidad los haplotipos de las poblaciones del norte, entre los 29o y 39o latitud sur, y del sur de la distribución de la especie desde los 46o latitud sur. Mientras que el clado B reúne las poblaciones del centro de la distribución (de las provincias de Río Negro y Chubut) entre los 39o y 46o latitud sur. Estos dos clados responderían a dos expansiones relativamente recientes y muy cercanas desde un mismo centro de origen donde la primera (clado A) se expande en su inicio hacia el norte para volver y expandirsehacia el noreste y el sur, luego de lo cual es desplazada por la segunda (clado B) en el centro de la distribución de la especie en su propia expansión desde la zona del noroeste de Patagonia (Río Negro) hacia el sur y este de Chubut y, quizás también, hacia el norte y sur de la distribución. Además, Zaedyus pichiy presenta una cierta correspondencia geográfica por regiones según el análisis de varianza, el árbol y redes de haplotipos. El clado A tiene más relaciones soportadas y muestra más estructura en las redes en la región norte, lo que podría deberse a que sería la primera rama de la expansión más antigua. Dentro del clado B, la población RNP es la que tiene la mayor variabilidad haplotípica y el haplotipo más abundante. También muestra cierta estructura y un subgrupo de haplotipos divergentes por lo que sería la más antigua de este clado y la más cercana al centro de origen, que estaría entre el río Neuquén y el río Limay, mostrando diferentes pulsos de expansión desde dicho centro. El resto de las poblaciones del clado muestra una estructura en estrella en las redes, lo que representaría la expansión reciente hacia el este y sur. La zona del centro de origen de las poblaciones actuales Zaedyus pichiy obtenido en este estudio concuerda con una zona de estabilidad en cuanto a los vientos y precipitaciones durante los ciclos glaciares del pleistoceno (refugios pleistosenicos) para vertebrados y plantas. Según la variación existente la presencia de los ríos está comenzando a actuar como quiebre y estructurando a las poblaciones por regiones, pudiéndose explicar por el aumento de caudal de los ríos pasada la última glaciación. A pesar que la variabilidad nucleotídica y haplotípica detectada fue alta en todas las poblaciones, parece ser posible detectar gradientes asociados a los principales macroambientes (diferenciados principalmente de oeste a este) en ambos clados (A y B) y también de norte a sur de la distribución sobre todo en el clado A, que es el que posee mayor distribución latitudinal. Se detectó señal de expansión poblacional en Zaedyus pichiy, aunque no tan pronunciada en el clado A por ser el primero en tener una gran expansión sobre todo hacia el norte, llegando a tener una distribución más amplia a la actual según el registro arqueológico. Actualmente se muestra señales de estructuración en esa región y de desplazamiento en el centro sur por el clado B, mostrando su expansión más actual al sur en Santa Cruz. Las mismas causas de aumento de temperatura y cambio en los biomas que habrían generado la retracción en el norte de la distribución serían las causantes de las expansiones en Patagonia que seguirían sucediendo en la actualidad la primera en la parte sur (clado A) y la segunda en la parte central de Patagonia (clado B). Los resultados de esta tesis solo muestran el último ciclo de retracción/expansión-recolonización de Zaedyus pichiy desde lo que sería aproximadamente el centro de su distribución actual en dos olas consecutivas, la primera más rápida, alcanzó una mayor distribución, en tanto que la segunda logró establecerse en la parte norte de la Patagonia remplazando a la primera. Esto llevo a formar dos unidades filogeográficas diferenciadas (clados A y B), dando una distribución particular de la diversidad de sus haplotipos la cual no siguen un gradiente latitudinal de norte a sur de la distribución de la especie como se planteó al comenzar el estudio.

Zaedyus pichiy is an armadillo that belongs to the Euphractinae Subfamily along with species of the genera Chaetophractus and Euphractus. The origin and relationships between the current species of Euphractinae are not resolved, however its radiation is related to important environmental changes caused by the rise of the Andes mountain range. The fossil records for the subfamily’s current genera date back to the late Miocene while the records for their species are from the Pliocene / Pleistocene. On the other hand, it is believed that the distribution of all current armadillos has been affected by climatic and sea level fluctuations, characteristics of the Pleistocene, due to the advance and retreat of glaciers that caused the retraction and expansion of biomes. Zaedyus pichiy has most of its wide distribution in Argentina, having spread to Chile recently. As the title indicates, this study aims to provide knowledge about the phylogeographic history of Zaedyus pichiy in Argentina, where most of its evolutionary history took place. However, the first question that arises is where and when did Zaedyus pichiy originate?, which leads to questions about the evolutionary history of the Euphractinae subfamily to which it belongs, such as: How and when was the origin of the current species of the Euphractinae, it was an early radiation in the late Miocene-early Pliocene in the Pampean Region?, coinciding with the earliest records of their genera in that period and region; How is Zaedyus pichiy related to the rest of the current genera of Euphractinae? Currently there are two hypotheses, one suggest that the genus Chaetophractus is paraphyletic with C. villosus being related to Euphractus, and C. vellerosus being a sister species to Zaedyus pichiy, while in the traditional one, the genus Chaetophractus is monophyletic, being grouped with E. sexcinctus, Z. pichiy being the first line to emerge. And finally, delving into Zaedyus pichiy, what is the genetic diversity of its populations, how is it currently distributed and what was the history of its populations to reach it, what factors shaped it? Were the cyclical climate changes that occurred during the Pleistocene? if so, the diversity of the haplotypes of their populations should be distributed in a latitudinal gradient, the most ancestral in lower latitudes, while evolutionarily derived in higher latitudes, showing the most recent expansion due to the increase in temperature. To try to answer these questions, i set the following objectives: (1) To clarify the phylogenetic relationships between the current species of Euphractinae, to determine their divergence times, and their possible ancestral areas. (2) Analyze the phylogeographic pattern of Zaedyus pichiy throughout its range in Argentina and examine the relationship between this pattern and the geomorphological history of the region. First, the characterization and analysis of the sequences obtained from a portion of the Control Region (CR) of the D-loop, and from a portion of the cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene of mitochondrial DNA in representative species of the Magorden Xenarthra, delving into the structure of D-loop sequences and their possible implications.The phylogenetic relationships of the current species of the Euphractinae subfamily were initially approached by means of the traditional methods of phylogenetic inferences (Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Inferences) analyzing a portion of the COI gene. Sequences of this marker were used for 16 specimens belonging to Euphractinae, with several sequences for each taxonomic unit, as well as 13 sequences for representatives of the rest of the Cingulata subfamilies and 6 sequences from the Pilosa clade that were used as outgroup. Obtaining a final alignment matrix of 35 total individuals and 658 bp. In addition, the species tree was estimated through the Bayesian method based on coalescence that estimates the phylogeny of multiple markers and a test of phylogenetic hypotheses was carried out forcing monophyly between the different species, each hypothesis being a different combination between two current species of the subfamily. For these analyzes, 51 partial sequences of the COI mitochondrial gene with a length of 658 bp were used, obtained in this study and others available in public databases. Also, 19 sequences available from the von Willebrand factor (vwf) gene with a length of 1145 bp and 17 from the breast cancer 1 (BRCA1) gene of 2851 bp in length were used. Finally, using the species tree, an attempt was made to approximate the territory where this diversification occurred, making an analysis of ancestral areas by methods based on Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Inferences. For the comprehensive phylogeographic study of Zaedyus pichiy in Argentina, the portions of the COI gene and the Control Region (D-loop) were used. Either analyzing the matrix of both concatenated markers (COI + Dloop) or their matrices separately. The matrix obtained from the concatenated markers was 1115 bp in length, with 112 sequences of which 37 are from individuals in which both markers were sequenced, 26 have sequences for the COI marker and 49 individuals for D-loop, having a considerable amount of missing data. Due to this, a smaller matrix of concatenated markers (COI + D-loop) was also used, with no missing data of 28 sequences and 967 bp. As well as the separate marker arrays reduced to as many sequences and base pairs as possible with the least amount of missing data possible. Obtaining for the COI marker matrix 59 sequences of 492 bp in length, where 27 haplotypes were identified and where the haplotype and nucleotide diversities were 0.933 and 0.01420 respectively, while for the D-loop fragment a matrix of 75 sequences were obtained with a length of 405 bp and 38 haplotypes with a haplotype diversity of 0.957 and nucleotide diversity of 0.01559. The genetic diversity and population structure of the species were analyzed, as well as the demographic history and the congruence between the estimates of the inferred processes for the species with the paleontological and archaeological record and paleoclimate studies was analyzed, relating it to its life history characteristics, in order to gain a better understanding. Regarding the structure of the D-loop sequences: An 80 bp fragment was found that is repeated in the sequences of the first portion of the D-loop CR in the armadillo species studied. The repeat motif is adjacent to the sequence of the TAS domain of said region and its origin would be caused by a unidirectional slippage of replication in a 3'-5 'direction. The most parsimonious explanation for the evolution of repeats in current Euphractinae species with implications for the phylogeny of the subfamily is that there is a greater closeness between Zaedyus and Chaetophractus, a hypothesis that does not agree with the classical phylogeny of Euphractinae. The heterogeneity found in this subfamily makes it difficult to propose a general pattern of variation in the repetitions of the CR of the D-loop. Regarding the phylogeny of the subfamily: The traditional analyzes of the COI marker did not resolve the relationships within the Euphractinae subfamily and when combined with the nuclear markers in the partitioned Bayesian analysis, it is argued that Zaedyus pichiy is the basal species of the subfamily, coinciding with the traditional hypothesis. However, the clade Euphractus + Chaetophractus receives moderate support. In the analysis of the different delimitation hypotheses, the hypothesis that groups E. sexcintus with C. villosus is the one that would present the least ambiguity. Therefore discrepancies remain in the coding marker results. In this study, it is ruled out that the discrepancies are due to the inclusion of a single species of the genus Chaetophractus or to the evolutionary rate of the marker used, stating the recent and rapid diversification of the subfamily as the main cause. The origin of the clade that contains the current species of Euphractinae is 3.60 Ma (95% HPD: 1.75-7.53), being a little more recent than in previous studies and coinciding with the estimates of the last stages of the Andean uplift and the consequent formation of dry biomes in the southern cone, which took place in the Pliocene. These events also explain the separation between Zaedyus with Euphractus + Chaetophractus which is 2.92 Ma (95% HPD: 1.02-6.16). On the other hand, the differentiation of Chaetophractus in its species has an estimated age of 2.42 Ma, which is supported by the fossil record and coincides with the beginning of the Pleistocene, a period characterized by fluctuations in climate until the glaciers cycles were established. According to biogeographic analyzes, the origin of the clade Euphractinae is the area of the temperate deserts of central Argentina. The separation between their species turned out to be more recent than the hypothesis proposed about an early radiation in the late Miocene-early Pliocene in the Pampean Region, where the records of their genera begin. The results in this work reject this hypothesis and bring these origins closer to the establishment of current species in the fossil record, covering the interval from the Middle Pliocene to the Pleistocene and proposing the temperate deserts of central Argentina as the area of occurrence. Regarding the Zaedyus pichiy Phylogeography: This species has a certain and particular geographical structure, two differentiated phylogeographic units within its wide range of distribution can be identified. Clade A combines almost entirely the haplotypes of the northern populations, between 29º and 39º south latitude, and the south of the distribution of the species from 46º south latitude. While clade B gathers the populations of the center of the distribution (of the provinces of Río Negro and Chubut) between 39º and 46º south latitude. These two clades would respond to two relatively recent and very close expansions from the same center of origin where the first (clade A) expands at the beginning towards the north to return and expand towards the northeast and south, after which it is displaced by the second (clade B) in the center of the distribution of the species in its own expansion from the northwestern part of Patagonia (Río Negro) towards the south and east of Chubut and, perhaps also, towards the north and south of the distribution. In addition, according to the analysis of variance, the tree and haplotype networks, Zaedyus pichiy presents a certain geographical correspondence by regions. Clade A has more supported relationships and shows more structure in the networks in the northern region, which could be because it would be the first branch of the oldest expansion. Within clade B, the RNP population is the one with the highest haplotid variability and the most abundant haplotype. It also shows a certain structure and a subgroup of divergent haplotypes so it would be the oldest of this clade and the closest to the center of origin, which would be between the Neuquén River and the Limay River, showing different expansion pulses from origin’s center. The rest of the populations of the clade show a star structure in the networks, which would represent the recent expansion towards the east and south. The zone of the center of origin of the current Zaedyus pichiy populations obtained in this study matches with a zone of stability in terms of winds and rainfall during the Pleistocene glacial cycles (Pleistocene refuges) for vertebrates and plants. According to the existing variation, the presence of the rivers is beginning to act as a break and structuring the populations by regions, which can be explained by the increase in the flow of the rivers after the last ice age. Although the nucleotide and haplotide variability detected was high in all populations, it seems to be possible to detect gradients associated with the main macroenvironments (differentiated mainly from west to east) in both clades (A and B) and also from north to south of the distribution especially in clade A, which is the one with the greatest latitudinal distribution. A sign of population expansion was detected in Zaedyus pichiy, although not so pronounced in clade A because it was the first to have a great expansion, especially towards the north, reaching a wider distribution than the current one according to the archaeological record. Currently, there are signs of structuring in that region, also displacement in the south-central region by clade B, showing its most current expansion to the south in Santa Cruz. The same causes of temperature increase and change in the biomes that would have generated the retraction in the north of the distribution would be the cause of the expansions in Patagonia that would continue to occur today, the first in the southern part (clade A) and the second in the central part of Patagonia (clade B). The results of this thesis only show the last retraction / expansion-recolonization cycle of Zaedyus pichiy from what would be approximately the center of its current distribution in two consecutive waves, the first faster, reaching a greater distribution, while the second managed to establish itself in the northern part of Patagonia, replacing the former. This led to the formation of two differentiated phylogeographic units (clades A and B), giving a particular distribution of the diversity of their haplotypes which does not follow a latitudinal gradient from north to south of the distribution of the species as was proposed at the beginning of the study.