Optimización de un sistema de modificación génetica de <i>Populus</i> sp para la incorporación de genes inductores de floración temprana y androesterilidad

Abstract

El álamo se ha convertido en un organismo forestal modelo para estudios fisiológicos, genómicos y moleculares. Se considera un árbol ideal en los estudios de genética forestal y biotecnología, por su rápido crecimiento, su capacidad de reproducción vegetativa, genoma relativamente pequeño y facilidad de transformación con Agrobacterium, sumados a su importancia económica a nivel mundial y nacional. La liberación al medio de álamos genéticamente modificados (GM) tiene limitantes, tanto desde el punto de vista ambiental, como comercial y de percepción pública. En lo relacionado al impacto ambiental, muchos cuestionan el largo tiempo que estará presente el árbol GM en el medio, por lo que existirían riesgos asociados con flujo génico. Si fuese posible obtener árboles GM estériles, se evitarían estos riesgos, dado que el árbol no produciría polen, con la ventaja adicional de redireccionar la energía en el crecimiento vegetativo, lo cual implicaría un menor tiempo de rotación. Sin embargo, para poder evaluar la esterilidad, es necesario que estos individuos florezcan. La mayorı́a de los á lamos no florecen antes de los siete añ os de edad, y a muchos les toma má s tiempo. Esto no só lo impone una restricció n de la aplicabilidad de técnicas genéticas experimentales convencionales, sino que, una vez introducido un gen de esterilidad, el tiempo para poder evaluarlo es muy largo. Esta tesis tuvo el propósito de trabajar con Populus tremula L. como árbol modelo y con P. deltoides e híbridos derivados. La hipótesis planteada fue que se puede acortar el tiempo de evaluación de álamos GM androesteriles mediante la modificació n del tiempo de la floració n, a través de la expresió n conjunta de dos transgenes. El objetivo general fue optimizar un sistema de modificación génetica de Populus sp para la incorporación de los genes de floración precoz y androesterilidad (HSP::AtFT y PsEND1::barnase), acelerando el tiempo de obtención de líneas transgénicas dobles. Se logró ajustar un método eficiente de regeneración de plantas in vitro de clones recalcitrantes de Populus deltoides y clones del híbrido Populus x euramericana. Se obtuvieron importantes avances en la transformación de P. deltoides y P. x euramericana, obteniéndose líneas transgénicas portadoras del gen de floración precoz para ambas especies, que regeneraron en plantas completas. Este estudio representa un gran avance en la transformación del P. deltoides y P. xeuramericana siendo éstos los primeros álamos de estas dos especies con la característica de floración precoz. Se obtuvieron líneas transgénicas dobles de P. tremula 22 L., conteniendo tanto el gen de floración precoz como el de androesterilidad (HSP::AtFT y PsEND1::barnase) a partir de la transformación genética en simultáneo, con dos diferentes cepas de Agrobacterium tumefaciens. Esto permite acelerar notoriamente el tiempo de transformación cuando se quiere incorporar más de un gen de interés a una planta. Todas las líneas transgénicas fueron corroboradas por PCR con diferentes primers específicos para cada gen y sus promotores respectivos y/o el gen de selección. Los análisis de Southern blot han servido para confirmar las transformaciones y cuantificar el número de copias en algunas de las líneas transgénicas. Se evaluó el desarrollo de la floración precoz inducida por el constructo HSP::AtFT , al mismo tiempo que la androesterilidad, inducida por la expresión del constructo PsEND1::barnase en plantas de Populus tremula L. transgénicas. Confirmamos que el sistema HSP::AtFT en álamos combina una inducción de la floración precoz con un normal crecimiento vegetativo. La extracción y tinción de los granos de polen obtenidos confirma la fertilidad de las flores obtenidas con este sistema. La combinación del tratamiento de altas temperaturas con el tratamiento de bajas temperaturas permite la obtención de álamos transgénicos con flores fértiles, independientemente de la estación del año. Este sistema mostró ser eficiente incluso en plantas muy pequeñas. La etapa no reproductiva en esta especie es generalmente de 7-10 años, y pasó a ser de 4-6 meses. Este sistema también nos permitió realizar estudios relacionados a la esterilidad masculina. Con estos resultados podemos inferir que el sistema PsEND1::barnase es efectivo para obtener alámos masculinos transgénicos estériles. Se logró mediante el sistema barnase disminuir/anular la calidad y cantidad de polen viable en las plantas transgénicas. Este estudio tiene relevancia para ensayos de contenció n genética. Disponer de este protocolo eficiente de transformació n con genes de androesterilidad permitirá en un futuro modificar genéticamente clones de álamo de interés local para introducir, junto con esta característica, caracteres de importancia silvicultural, de forma controlada. También se podrán desarrollar clones de álamos con floración precoz para programas de mejora genética. Los resultados obtenidos nos permiten aceptar las hipótesis planteadas.