Participación del ácido 20-hidroxieicosatetraenóico (20-hete) en las vías de señalizacion en células de cáncer de próstata

Abstract

El ácido 20-hidroxieicosatetranóico (20-HETE) es el producto del metabolismo del ácido araquidónico por las isoformas con actividad 20-hidroxilasas del citocromo P450 (CYP4F2 y CYP4A11) y se ha demostrado que cumple un rol importante en la biología de diferentes tumores humanos. Recientemente, el receptor acoplado a proteína G, GPR75, fue identificado como blanco para el 20-HETE en células endoteliales humanas. Por otro lado, datos previos de nuestro laboratorio demostraron que la inhibición de la síntesis de 20-HETE disminuye significativamente la viabilidad de células de cáncer de próstata sensibles a andrógenos (LNCaP) a través de la interacción con la vía del receptor de andrógenos (RA). Así, el objetivo de este trabajo fue indagar sobre los mecanismos intracelulares comprometidos en las acciones protumorigénicas del 20-HETE en células de cáncer de próstata de origen humano, planteando como objetivos específicos: determinar si el 20-HETE modifica la actividad transcripcional del receptor de andrógenos en células de cáncer de próstata sensibles a los andrógenos, e identificar posibles vías intracelulares activadas por el 20-HETE en células de cáncer de próstata no sensibles a los andrógenos. A tal fin, se utilizaron dos líneas celulares de cáncer de próstata humano, una sensible a andrógenos (LNCaP) y otra línea no sensible a andrógenos (PC-3). Las células fueron incubadas con vehículo (control) o estimuladas con 20-HETE (0.1 nM) en presencia o ausencia de dos antagonistas del receptor GPR75: aspartato de sodio 19(R)-hidroxieicosa-5(Z), 14 (Z)-L-dienol (19-HEDE) o aspartato de sodio ((6Z, 15Z)-20-hidroxieicosa-6,15-dienol (AAA) (5 o 10 M para ambos); o con el agonista del RA, 5-dihidrotestosterona (DHT 10 nM). Se utilizaron las siguientes técnicas: western blot para determinar la expresión de proteínas totales o fosforiladoas. Inmunofluorescencia indirecta y/o fraccionamiento celular para evaluar la distribución subcelular de proteínas o cambios del citoesqueleto. Medición del antígeno prostático específico (PSA), cuya producción está bajo regulación del RA. Ensayo del gen reportero con un vector del PSA acoplado a luciferasa para evaluar la actividad transcripcional del RA. Ensayo de cierre de herida para la evaluación de la migración celular, y zimografía para la determinación de la actividad de la metaloproteasa de matriz- 2 (MMP-2). El análisis estadístico de los resultados se realizó utilizando el test de Student, o bien ANOVA de una vía, seguida de análisis por Tuckey. En primer lugar, se constató en ambas líneas celulares la expresión del receptor GPR75. Como ocurre con otros receptores asociados a proteína G, se observó una disminución significativa en su expresión después del estímulo con el agonista 20-HETE (p<0.0001 vs. control para LNCaP (36 h) y PC-3 (12 h)). En las células LNCaP se estudió el efecto del 20-HETE sobre algunos mecanismos dependientes del RA. El estímulo con 20-HETE (0.1 nM) incrementó la expresión del RA en un 37.35% (p<0.01 vs control, 36 h), la presencia nuclear del RA en un 62.8% (p<0.0001 vs control, 45 min), la actividad transcripcional del RA en 178% (p<0.0001 vs control, 36 h) y la secreción de PSA en un 58% (p<0.05 vs control, 36 h), siendo estas respuestas dependientes del receptor GPR75. La coincubación (36 h) con 20-HETE (0.1 nM) y DHT (10 nM) dio como resultado un efecto sinérgico en la actividad transcripcional del RA medido como un aumento del 58% sobre la señal de luciferasa obtenida con DHT sola (p<0.0001 vs DHT). En células PC-3 se indagaron los mecanismos independientes del RA. El estímulo con 20-HETE (0.1 nM) aumentó la expresión de la proteína clon-5 inducible por peróxido de hidrogeno (HIC-5) en 150% (p<0.0001 vs control, 12 h). Asimismo, incrementó la fosforilación (y consecuente activación) de varias moléculas de señalización intracelular tales como: EGFR (Tyr 1092), NF-B (Ser 536) y Akt (Ser 473) en 146, 172 y 219% respectivamente (p<0.01 para NF-kB, y p<0.001 para EGFR y AKT vs. Control, 2 hs). Además, el 20-HETE promovió la redistribución de p-Akt (p<0.01 vs control, 1h) hacia el núcleo, y de PKC del núcleo (p<0.05 vs control, 10 min) a la fracción de membranas (p<0.01 vs control, 10 min). También, la presencia de 20-HETE (0.1 nM) promovió la transición epitelio mesenquimal (TEM) a través de la disminución en la expresión de e-caderina en un 40% (p<0.0001 vs control, 24 h) y el aumento de la vimentina en 150% (p<0.0001 vs control, 24 h), e incrementó la actividad de MMP-2 en 52% (p<0.05 vs control, 24 h). Respecto de la remodelación del citoesqueleto, el 20-HETE aumentó las fibras de estrés de F-actina, e incrementó la fosforilación de la quinasa de adhesión focal (FAK) (Tyr 397) en 89% (p<0.0001 vs. Control, 24 h). Los ensayos funcionales mostraron que el 20-HETE aumentó el porcentaje de migración celular del 48,9% (p<0.0001 vs control, 16hs). La inhibición de las vías de: PKC (RO318220, 100 nM), PI3K/AKT (LY194002, 25 mM) y NF-kB (sulfasalazina, 500 M) disminuyeron el porcentaje de migración celular activado por el 20-HETE en 37.3, 33.0 y 24.8% respectivamente (RO318220 p<0.001, LY294002 y sulfasalazina p<0.0001 vs. 20-HETE solo, 16 h). Más aun, la inhibición de PI3K/AKT y NF-kB disminuyó la migración celular per se (p<0.01 y p<0.0001 vs. control respectivamente). El antagonista del receptor GPR75 (AAA, 10 M) revirtió todos los efectos del 20-HETE. Más aún, el antagonista por si solo aumentó la fosforilación de p-38 (Tyr 182) en 248% (p<0.0001 vs control, 2 h), disminuyó la presencia nuclear de Akt, p-Akt y NF-k (Akt p<0.01, p-Akt y NF-kB p<0.0001 vs control, 1h). Los resultados del presente trabajo de tesis proveen evidencias sobre los mecanismos intracelulares comprometidos en las acciones protumorigénicas del 20-HETE en células de cáncer de próstata y demuestran que ellas requieren del estímulo del receptor GPR75. De esta manera, el antagonismo del receptor GPR75 podría ser considerado en el futuro como una interesante y novedosa diana terapéutica para el tratamiento de cáncer de próstata.