Expresión génica simultánea y regulada del péptido tímico timulina y la green fluorescent protein utilizando un sistema adenoviral Tet-Off

Abstract

Introducción: Una de las cuestiones clave en la implementación exitosa de terapias génicas radica en la capacidad de regular la expresión consistentemente. Con este propósito, y a fin de ampliar nuestros estudios en timulina y su papel en el desarrollo del eje hipotálamo-hipófiso-ovárico, construimos un sistema bivectorial regulable Tet-Off que expresa, simultáneamente, los transgenes para green fluorescent protein (GFP) y metFTS (análogo de timulina). Objetivos: Estudiar la funcionalidad y regulabilidad de nuestro sistema in vitro y evaluar la expresión in vivo mediante su inyección en músculos y ventrículos cerebrales de ratas. Materiales y métodos: El sistema experimental consta de dos adenovectores recombinantes (RAd): el RAd-(GFPTRE- FTS)bidir, unidad de respuesta en la cual la transcripción de los transgenes se encuentra controlada por un promotor bidireccional inducible por doxiciclina, y el RAd-tTA, unidad transactivadora que expresa la proteína regulatoria tTA. El sistema control no expresa metFTS. La expresión de GFP se determinó por microscopía y fluorometría. La timulina bioactiva fue medida por un bioensayo de rosetas. Resultados y conclusión: El sistema construido mostró ser activo tanto en experimentos in vitro, donde células CHOK1 incubadas con ambos RAds mostraron una eficiente expresión de los transgenes, pudiendo inhibirse por el agregado de doxiciclina al medio de cultivo; como in vivo, donde se dosaron niveles significativamente aumentados de timulina sérica y en LCR en ratas inyectadas intramuscular e intracerebrovectricularmente con ambos RAds, respectivamente. La utilización del gen de la GFP en nuestro sistema sirvió para comprobar, sencilla y rápidamente, la transcripción del gen de la timulina.