Efectos de la protección mediada por la producción de interferón gamma en células bovinas estimuladas por Neospora caninum

Abstract

El objetivo de este trabajo fue analizar la respuesta inmune mediada por células en la infección por Neospora caninum a través de la utilización de un modelo in vitro. Se obtuvieron células esplénicas de bovinos serológicamente negativos a N. caninum y se estimularon con taquizoítos de la cepa NC-1 de N. caninum vivos (tratamiento Gl), inactivados con formol y calor (tratamiento GF) y con productos de su lisado (tratamiento GS), dejando células sin estimular como controles (GC). En los sobrenadantes de estos cultivos se determinó la concentración de interferon gamma (IFNy) mediante una prueba de ELISA comercial (Bovigam™), resultando en todos los casos negativos con respecto al testigo provisto por el equipo. Se obtuvieron las células esplénicas, se tiñeron con Giemsa y se observaron para la detección de cambios morfológicos. Las células de los grupos Gl y GS mostraron cambios compatibles con activación celular, mientras que en las células del tratamiento GF no se observaron cambios. Se incubaron cultivos de monocitos bovinos (BM) con los sobrenadantes de los diferentes tratamientos de las células esplénicas, los que se desafiaron con taquizoitos de N. caninum. En las células BM cultivadas con los sobrenadantes de los tratamientos Gl, GS, y GF se observaron diferencias en la multiplicación del parásito. Las células se tiñeron para determinar el porcentaje de áreas de lisis en cada tratamiento con respecto al área total, utilizando el programa Image Pro Plus. Los resultados fueron: tratamiento Gl 3,66 %, GF 7,98 %, GS 10,70 % y GC 16,67 %. Se observaron diferencias significativas entre los grupos (x2 p< 0,001). Para determinar la producción de IFNy en las células esplénicas cultivadas, se obtuvo el ADN específico a partir del ARN mensajero y se realizó la prueba de RT-PCR. Los productos amplificados provenientes de las células de los tratamientos Gl y GS revelaron bandas de 261 pb específicas. Se concluye que el lisado de taquizoitos de N. caninum vehiculizado con un adyuvante adecuado sería una alternativa eficiente para la inmunoprofilaxis de la neosporosis.

The aim of this work was to analyse the cellular immune response to Neospora caninum through an in vitro model. Bovine spleen cells from cows serologically negative to N. caninum were cultured and stimulated with live N. caninum tachyzoites (group Gl), formalin- heat- inactivated tachyzoites (GF), and a tachyzoite lysate (GS). Uninfected cells were used as a negative control. An ELISA test for IFNy (Bovigam™) was performed on supernatants from N. caninum treated cells, with negative results in all treatments respect to the standard provided by the kit. N. caninum stimulated and control spleen cells were stained with Giemsa and typical activation morphology was observed in cells from Gl and GS groups, while no change were observed in group GF. Supernatants from each N. caninum treatment were placed on monocyte bovine cells (BM) culturesand them were inoculated with live N. caninum tachyzoites. Supernatant from cell groups Gl, GF and GS had a protective effect on BM cells. Lysis plaque formation was evaluated on the BM cell monolayer using Image Pro plus software. Significative differences were observed among groups (x2 p< 0.001). The lysis plaque percentage of each treatment was: Gl 3.66%, GF 7.98%, GS 10.70% and GC 16.67%. IFNy mRNA expression in spleen cells was evaluated by RT-PCR, revealing IFNy expression in cells from group Gl, as well as in group GS. It is concluded that tachyzoite lysate combined with an appropriate adjuvant may provide a valuable tool for inmunoprofilaxis of the neosporosis.