Análisis genómico-funcional de la embriología de <i>Rhodnius prolixus</i> (Ståhl, 1859) (Hemíptera, Reduviidae)

Abstract

La genómica y biología del desarrollo de Rhodnius prolixus (vector de la enfermedad del Chagas) no fue estudiada sino hasta recientemente. El genoma de R. prolixus fue secuenciado y actualmente se encuentra en proceso de anotación. En este contexto, y dentro del consorcio de secuenciación del genoma de R. prolixus, se llevó a cabo la construcción de una genoteca normalizada de ADNc incluyendo todos los estadíos de desarrollo, desde huevos hasta insectos adultos, tanto hembras como machos. Tanto esta genoteca como la última versión de anotación del genoma de R. prolixus fueron utilizados para la búsqueda de genes de segmentación. Los genes identificados y caracterizados fueron los siguientes: giant, krüppel, hunchback, knirps, tailless, orthodenticle, empty-spiracles, forkhead, hairy, even skipped, runt y engrailed. A partir de la genoteca normalizada de ADNc se clonaron los genes Rp-gt y Rp-Kr, los cuales fueron caracterizados, mostrando su patrón de expresión y función durante el desarrollo embrionario. Mediante el análisis bioinformático de la región genómica upstream de las unidades transcripcionales de Rp-gt y Rp-Kr, se pudo identificar (para cada uno de estos genes) un potencial elemento regulatorio. Estos resultaron ser similares en posición y composición a los sitios de unión a factores de transcripción analizados en Drosophila melanogaster. Como referencia también se analizo la región equivalente en Tribolium castaneum. Rp-gt muestra expresión materna, de forma tal que el transcripto se encuentra en ovarios y oocitos sin fertilizar. En embriones en estadío de pre-blastodermo la distribución del transcripto es en parches formando un gradiente posterior. La expresión cigótica de Rp-gt se da en dos dominios, uno cefálico y otro abdominal. Mediante ARNi parental, se pudo ver que Rp-gt es requerido para la correcta formación de la cabeza y el abdomen. La cabeza pierde los apéndices mandibulares y maxilares, se reduce la longitud del clípeo-labro y el abdomen pierde segmentos anteriores. La expresión de Rp-Kr es cigótica. Durante el proceso de invaginación del embrión, Rp-Kr se expresa en la mitad posterior del huevo, mientras que durante el estadío de banda germinal se expresa en la parte central del embrión, desde el segmento torácico T2 hasta los primeros segmentos abdominales. Los embriones interferidos para Rp-Kr presentan una alteración del patrón de segmentación. Estas alteraciones corresponden a la zona media del embrión, donde se pierden el 2do y 3er segmento torácico y el abdomen se reduce de diez a seis segmentos. Además, los embriones con fenotipo interferido, muestran dificultades en la formación del segmento labial y T1, y cambios homeóticos, en los cuales aparece un peine tibial ectópico en la tibia de la pata T2. En la presente tesis doctoral, se muestra un análisis bioinformático de una genoteca normalizada de ESTs y la caracterización de la mayoría de los ortólogos de genes de VI segmentación para R. prolixus. Mostramos las potenciales regiones regulatorias para los genes Rp-gt y Rp-Kr, cuya posición se encuentra evolutivamente conservada tanto en D. melanogaster como en T. castaneum. Por último, se demuestra tanto estructural como funcionalmente que Rp-gt y Rp-Kr son verdaderos genes gap, el primero para la región cefálica y abdominal, y el segundo en la región central del embrión de R. prolixus.