Modulación de los canales de calcio presinápticos por variantes de receptores acoplados a proteína G humanos: "el receptor opioide mu y el receptor de ghrelina"

Abstract

Los canales de calcio activados por voltaje pre-sinápticos (CaV2) son proteínas de transmembrana altamente especializadas en la transducción de señales eléctricas en señales químicas. Dado que, en las terminales axonales, la entrada de Ca2+ a través de los CaV2 es condición necesaria para la liberación de neurotransmisores, su modulación constituye un blanco regulatorio de alta efectividad de la actividad neuronal. Dentro de los mecanismos que regulan la actividad de los CaV2 en las membranas pre-sinápticas se encuentra la activación de diversos receptores acoplados a proteína G (GPCR, del inglés G protein coupled receptor). Estos receptores modulan negativamente la actividad de los CaV2 y, en consecuencia, reducen la liberación de neurotransmisores tanto excitatorios como inhibitorios dependiendo de la sinapsis en la que actúen. Los GPCRs constituyen una súper-familia de receptores activados por una gran variedad de ligandos y, dada su participación en múltiples procesos fisiológicos representan blancos terapéuticos muy importantes. La unión de un ligando a su GPCR desencadena la activación de la proteína G, la cual al activarse se escinde en sus subunidades Gα y Gβγ siendo capaces de activar diversas cascadas de señalización intracelular y modular múltiples efectores intracelulares, entre los que se encuentran los CaV2 pre-sinápticos. Sin embargo, el 15 % de los GPCRs pueden adquirir un estado activo en ausencia de ligando que podría potencialmente impactar en la actividad de los CaV2. Adicionalmente, tanto esta actividad constitutiva como la actividad dependiente de agonista pueden verse drásticamente alteradas por la presencia de variaciones en la secuencia de los genes que codifican los GPCRs. Así, debido a los distintos modos de activación y a los subtipos que ocurren como consecuencia de variantes de los GPCRs, es preciso realizar estudios detallados de los mecanismos que median los efectos de cada GPCR de interés para el desarrollo de estrategias farmacológicas efectivas. En este contexto, en el presente trabajo de tesis estudiamos el impacto de la activación de dos GPCRs fisiológicamente muy relevantes sobre la actividad de los CaV2 pre-sinápticos: el receptor opioide μ (MOR, del inglés μ opioid receptor), el cual constituye la principal puerta de entrada de los potentes efectos analgésicos de los opioides más eficaces y utilizados en la historia humana; y el receptor de ghrelina (GHSR1a, del inglés growth hormone secretagogue receptor type 1a), receptor de la única hormona orexigénica y el cual despliega la actividad constitutiva de mayor nivel conocida entre los GPCRs. Adicionalmente, evaluamos cómo variantes de los genes que codifican ambos receptores modifican su actividad y determinamos sus frecuencias en nuestra población. El polimorfismo de un nucleótido N40D de MOR, cuya frecuencia varía notablemente entre las poblaciones humanas, altera las funciones celulares del receptor llevando a diferencias en la sensibilidad al dolor y al tratamiento con opioides. La activación de MOR por agonistas opioides en las terminales de neuronas periféricas que transmiten la sensación dolorosa, inhibe los CaV2.2 disminuyendo, consecuentemente, la liberación de neurotransmisores excitatorios que potencian la señal dolorosa. En estas neuronas se expresa en forma exclusiva una isoforma de splicing alternativo de los CaV2.2, CaV2.2e37a, que posee una sensibilidad aumentada a MOR. En este trabajo evaluamos si la activación de los subtipos de MOR producto de N40D (MOR-N y MOR-D) tiene un impacto diferencial sobre la actividad de los CaV2.2e37a exclusivos de las vías del dolor. Utilizando como modelo de estudio un sistema de expresión heteróloga, mediante la técnica patch-clamp en configuración de célula entera con fijación de voltaje, encontramos que N40D impacta en los efectos inhibitorios de MOR sobre los CaV2.2 provocando una ganancia de función para inhibir las corrientes CaV2.2 pre-sinápticas mediadas por la isoforma de splicing del canal específica de las vías del dolor, CaV2.2e37a, y por la isoforma de splicing de expresión ubicua en el sistema nervioso, CaV2.2e37b. Así mismo, nuestro análisis genético-poblacional reveló que N40D se encuentra en un ~ 18 % en una región de nuestro país y, que su distribución a lo largo de distintas poblaciones mundiales, permite identificar una estructura poblacional formada por tres grupos que se corresponden a distintos linajes de ancestría humana. De esta manera, nuestros resultados sugieren que el polimorfismo humano N40D de MOR impacta en la respuesta fisiológica de la activación de este receptor y que podría estar involucrado, de manera condicionada por la ancestría, en las diferencias inter-individuales de la sensibilidad al dolor y tratamientos opioides. Por otro lado, GHSR1a es el único receptor conocido de la hormona ghrelina. Esta hormona es sintetizada en células endócrinas del estómago, y desde allí llega hasta el cerebro donde casi exclusivamente accede al hipotálamo provocando sus potentes efectos orexigénicos. Ghrelina, tras unirse a GHSR1a, activa transcripcional y eléctricamente a las neuronas hipotalámicas por mecanismos post-sinápticos, sin embargo, GHSR1a también se localiza en las membranas pre-sinápticas, en donde se desconoce si contribuye a dicha activación neuronal. Curiosamente, GHSR1a es el GPCR con mayor actividad constitutiva conocido y tampoco se conoce si esta activación independiente de ghrelina participa en la activación neuronal. Dado que los CaV2 son muy sensibles a la modulación por GPCRs, indagamos si GHSR1a impactaba en la actividad de los CaV2. Utilizando como modelo un sistema de expresión heteróloga, mediante patch-clamp en configuración célula entera y con fijación del voltaje, encontramos que la activación de GHSR1a inhibe drásticamente las corrientes CaV2.1 y CaV2.2. Mientras su actividad constitutiva modula los CaV2 por una disminución crónica de la densidad de canales en la membrana plasmática dependiendo de los niveles de expresión del receptor y por un mecanismo mediado por la proteína Gi/o; la actividad de GHSR1a evocada por ghrelina modula negativamente la actividad de los CaV2 pre-sinápticos de manera reversible y saturable a niveles muy bajos del receptor. Adicionalmente, la inhibición mediada por la activación de GHSR1a por ghrelina involucra a ambas subunidades de la proteína Gq, siendo más sensibles a esta inhibición los CaV2.2 que los CaV2.1. También encontramos que una propiedad fundamental de esta inhibición, como es la dependencia del voltaje, se altera completamente dependiendo del subtipo de subunidad auxiliar CaVβ que acompaña al canal. Para estudiar si la actividad de GHSR1a expresado a niveles nativos y en un contexto neuronal modula las corrientes CaV2 utilizamos cultivos primarios de neuronas hipotalámicas de rata sobre-expresando GHSR1a y de un modelo de ratón transgénico que expresa eGFP (del inglés enhanced green fluorescent protein) bajo el promotor del gen GHSR. En estos experimentos encontramos que GHSR1a es capaz de reducir las corrientes CaV2 pre-sinápticas en neuronas hipotalámicas tanto por su actividad constitutiva como por la dependiente de ghrelina. Posteriormente, indagamos también el efecto de la mutación A204E humana de GHSR1a, que elimina la actividad constitutiva del receptor, y su prevalencia en una población argentina. Encontramos que A204E impacta en la modulación de los CaV2 pre-sinápticos por GHSR1a provocando una inhibición de las corrientes CaV2 sólo cuando es activado por ghrelina tanto es un sistema de expresión heteróloga como en neuronas hipotalámicas en cultivo. Adicionalmente, A204E no constituye un sitio de variación genético-poblacional en la población argentina analizada. De esta manera, A204E, con un impacto poblacional muy bajo, provoca una pérdida de función del rol modulatorio de GHSR1a sobre las corrientes CaV2. Por último, abordamos un posible impacto fisiológico de la modulación de los CaV2 por GHSR1a. Dado que en el hipotálamo predomina un tono GABAérgico que controla diversos núcleos neuronales, estudiamos si la modulación de los CaV2 por GHSR1a regulaba la liberación de GABA en neuronas hipotalámicas como un posible mecanismo de activación neuronal. Encontramos que ambos modos de activación de GHSR1a regulan negativamente la liberación de GABA en neuronas hipotalámicas, sólo cuando la misma está mediada por mecanismos dependientes del ingreso de Ca2+ a través de los CaV a las terminales axonales. Este mecanismo podría cobrar relevancia fisiológica en situaciones de ayuno, cuando la expresión de GHSR1a se encuentra aumentada, contribuyendo a la activación neuronal descripta en estas condiciones fisiológicas. Nuestros datos demuestran que GHSR1a modula la actividad de los CaV pre-sinápticos tanto por vías convencionales de inhibición de los CaV (activación de GPCRs dependiente de agonistas), como por vías no convencionales (activación constitutiva de GPCRs), sugiriendo un rol fundamental de la actividad constitutiva de GHSR1a en la fisiología sináptica de neuronas hipotalámicas. Así, GHSR1a modula drásticamente las corrientes CaV2 pre-sinápticas por mecanismos completamente distintos dependientes de su modo de activación. En resumen, en esta tesis describimos por primera vez diferentes mecanismos no convencionales de modulación de los CaV2 pre-sinápticos por la activación de GPCRs. Esta modulación, sumamente efectiva para regular la actividad sináptica, requiere estudios detallados de sus componentes participantes que la median y de sus interacciones para poder comprender el alcance de la misma en distintos contextos celulares. Así mismo, demostramos que las variaciones de los genes de los GPCRs pueden alterar drásticamente su capacidad para modular los CaV2, llevando a grandes diferencias en las respuestas fisiológicas de las que participan, planteando además la relevancia de determinar el alcance poblacional de cada una de ellas para poder encarar estrategias terapéuticas.