Análisis de inestabilidad telomérica en la progenie de células de rata expuestas a mutágenos químicos y en un modelo murino de inducción tumoral

Abstract

Los telómeros son complejos nucleoproteicos localizados en los extremos de los cromosomas eucarióticos. Están involucrados en la preservación de la integridad de los mismos, protegiéndolos de la degradación por nucleasas y de la recombinación y fusión con otros cromosomas. Por lo tanto, el mantenimiento de la función telomérica resulta fundamental para la estabilidad genómica y la viabilidad celular. Dado que una cantidad importante de mutágenos químicos son utilizados como agentes antitumorales, el estudio del daño inducido a nivel genético por estos compuestos reviste gran interés. El objetivo general de este trabajo de Tesis Doctoral consistió en obtener nuevos conocimientos para lograr una mejor comprensión de los efectos de los mutágenos químicos sobre los telómeros de los cromosomas eucarióticos y estudiar la inestabilidad telomérica en un modelo murino de inducción tumoral. De este modo, se pretende establecer si los mutágenos químicos inducen inestabilidad telomérica retardada o persistente y si el desarrollo tumoral se relaciona o asocia con alteraciones específicas en el patrón de expresión de los genes ligados al mantenimiento telomérico. Para tal fin, en primer término se abordó el estudio de la inestabilidad telomérica (IT). Este comprende el análisis del daño cromosómico a nivel telomérico, los eventuales cambios en la longitud telomérica y en la actividad de la enzima telomerasa en la progenie de las células de rata ADIPO-P2, que fueron expuestas inicialmente a los mutágenos químicos bleomicina (BLM), estreptonigrina (EN) y estreptozotocina (EZ). Si bien se conocen parcialmente los efectos inmediatos o a corto plazo de algunos mutágenos químicos sobre los telómeros, se desconoce qué es lo que ocurre a largo plazo con los telómeros de las células que sobreviven al tratamiento con un mutágeno dado y si los mutágenos químicos inducen inestabilidad telomérica retardada tal como ocurre con las radiaciones ionizantes. El análisis de las aberraciones cromosómicas se llevó a cabo aplicando la técnica de PNA-FISH con sonda telomérica. Asimismo, se estudió la actividad de la enzima telomerasa, utilizando un kit comercial específico y la longitud telomérica se determinó mediante la técnica de Flow-FISH por citometría de flujo. Nuestros resultados demuestran que los mutágenos químicos BLM, EN y EZ pueden inducir inestabilidad telomérica hasta al menos 15 días después del tratamiento con los mismos. Asimismo, se evidenció que los llamados cromosomas incompletos (CI), a pesar de carecer de un extremo cromosómico, pueden ser transmitidos a la progenie de las células que fueron originalmente expuestas a dichos mutágenos. Además, se 5 determinó que las células expuestas a los mutágenos químicos mencionados son cromosómicamente inestables desde la primera división mitótica luego del tratamiento. Por otro lado, se observó que en las células ADIPO-P2 expuestas a los mutágenos, BLM, EN y EZ, la actividad de la enzima telomerasa depende de la presencia de telómeros cortos y no se correlaciona directamente con la inestabilidad telomérica registrada citogenéticamente. De esta manera, los resultados de la presente investigación permitieron obtener un mejor conocimiento de los efectos de los mutágenos químicos antitumorales sobre el genoma a largo plazo y por lo tanto, contribuirán a una mejor comprensión de su modo de acción sobre las células, lo cual resulta de fundamental importancia al momento de evaluar la eficacia y uso terapéutico de dichos compuestos. En segundo término, para determinar si el desarrollo tumoral in vivo se relaciona con alteraciones en el perfil de expresión de genes teloméricos (complejo shelterina), se estudió la actividad transcripcional de los genes responsables del mantenimiento telomérico. Para ello, se empleó la técnica de PCR en tiempo real en un modelo murino de inducción tumoral. Nuestros datos indican una disminución significativa de la actividad transcripcional en 2 de los 6 genes integrantes del complejo telomérico en mamíferos (trf1 y rap1). Esta alteración en la expresión de los mismos, podría considerarse como un posible marcador de inestabilidad genómica en melanoma murino. De este modo, mediante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, se lograron aportes significativos en relación a la inestabilidad telomérica existente a largo plazo a nivel telomérico, en células de mamífero (rata) expuestas in vitro a antibióticos antitumorales y la inestabilidad telomérica presente en un modelo in vivo de inducción tumoral (melanoma murino).