Evaluación de la diversidad fenotípica y genotípica de cepas de <i>Paenibacillus larvae</i> patógenas de abejas melíferas e investigación de los mecanismos moleculares de la resistencia a tetraciclina

Abstract

La enfermedad más grave de la etapa larval de las abejas (Apis mellifera L.) es la loque americana, causada por la bacteria esporulada Gram (+) Paenibacillus larvae. Es muy contagiosa y posee problemas únicos para su prevención y control debido a que las esporas bacterianas mantienen su capacidad infectiva durante tiempo prolongado y sobreviven bajo condiciones ambientales adversas, no existiendo brotes estacionales ya que se manifiesta en cualquier época del año con la condición que haya cría presente en la colmena. La enfermedad tiene difusión mundial y aparece en la lista de enfermedades de la OIE (Office International des Epizooties - Organización Mundial de la Salud Animal), que incluye enfermedades transmisibles que son consideradas de impacto socio-económico y/o de importancia para la salud pública entre países y que influyen negativamente en el comercio internacional de animales y productos de origen animal. En la Argentina se la detectó por primera vez en 1989 y actualmente está ampliamente diseminada en todas las áreas productoras de miel. Con el objeto de estudiar la diversidad de Paenibacillus larvae se aplicaron procedimientos de microbiología clásica y de biología molecular para caracterizar una colección de 455 cepas del patógeno. El cepario de trabajo se conformó con 106 aislamientos obtenidos de larvas de abejas con síntomas de la enfermedad, con 307 cepas aisladas de mieles contaminadas de distintos orígenes geográficos, 21 cepas provistas por otros laboratorios y 21 cepas de Colecciones Internacionales. Se identificaron 54 aislamientos de restos larvales y/o escamas con síntomas clínicos de la enfermedad y 252 aislamientos de mieles provenientes de distintas localidades de la Argentina. A partir de material de panales con síntomas clínicos remitidos por investigadores de otros países, se obtuvieron 52 aislamientos conformados por 3 aislamientos de Alemania, 5 de Francia, 5 de Italia, 9 de N. Zelanda, 6 de Polonia, 11 de Sudáfrica, 4 de Suecia, 1 de Túnez y 8 de Uruguay. Adicionalmente se aislaron 18 cepas de mieles de Italia, 17 de mieles de EE.UU., 7 de mieles de Francia, 5 de mieles de España, 3 de mieles de Canadá, 2 de mieles de Sudáfrica, 1 de miel de Brasil, 1 de miel de Túnez y 1 de miel de Panamá conformando un total de 55 cepas obtenidas de mieles de otros países productores. Fueron recibidas como cultivo 42 cepas: 2 de Argentina, 2 de Bélgica, 2 de Chile, 2 de Japón, 3 de Inglaterra, 4 de República Checa, 10 de EE.UU. y 13 de origen desconocido. Si bien la colección estuvo integrada por un alto número de cepas provenientes de Argentina (n= 308) el trabajo se realizó también sobre un número considerable de cepas (n=147) de otros orígenes que resultó adecuado para los estudios de diversidad. Adicionalmente, con el fin de incluir controles, se emplearon 5 cepas de Colecciones Internacionales que en la actualidad se clasifican como Paenibacillus larvae pero que pertenecían a la anterior subespecie Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens (1 de EE.UU., 1 de Canadá, 1 de Francia y 2 de origen desconocido). Otras cepas de este grupo proveniente de EE.UU. fueron gentilmente cedidas por el Dr. D. P. Stahly para los estudios con el bacteriófago PPL1c del capítulo III. Se constituyó un segundo cepario con una colección de 282 aislamientos bacterianos de otras especies esporuladas aerobias conformado por 129 aislamientos de Bacillus cereus, 62 de Paenibacillus alvei, 52 de Bacillus megaterium, 8 de Bacillus mycoides, 6 de Bacillus subtilis, 6 de Lysinibacillus sphaericus, 5 de Bacillus thuringiensis, 5 de Brevibacillus laterosporus, 5 de Bacillus circulans, 2 de Bacillus licheniformis, 1 de Bacillus polymyxa y 1 de Bacillus pumilus. Adicionalmente, se emplearon 41 cepas recibidas de Colecciones Internacionales y pertenecientes a distintas especies de los géneros Paenibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus y Virgibacillus. En el Capítulo II se caracterizaron las 455 cepas de Paenibacillus larvae mediante técnicas microbiológicas. El agregado de ácido nalidíxico al medio de cultivo a una concentración final de 9 µg/ml resultó adecuado para la obtención de cultivos puros de Paenibacillus larvae evitando el sobredesarrollo del saprobio Paenibacillus alvei comúnmente presente en las larvas de abejas. Con respecto a los aislamientos provenientes de muestras de mieles, el agregado de la combinación de antibióticos ácido nalidíxico y ácido pipemídico al medio MYPGP permitió obtener colonias de Paenibacillus larvae y mayormente inhibió el desarrollo de otras especies esporuladas presentes en este tipo de muestras, ya que más del 80% de las muestras analizadas contenía más de una especie bacteriana resistente al tratamiento de shock térmico de 80 °C. Independientemente del origen geográfico y/o floral de las mieles analizadas aquí, las especies esporuladas aerobias encontradas con mayor frecuencia han sido Paenibacillus larvae, Paenibacillus alvei, Bacillus cereus, Bacillus megaterium y Bacillus pumilus. Paralelamente y, en menor proporción, se hallaron cepas de Brevibacillus laterosporus, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Paenibacillus polymyxa, Lysinibacillus sphaericus y Bacillus licheniformis. Mientras que Paenibacillus larvae y Paenibacillus alvei están asociados con enfermedades de las abejas, Bacillus cereus y Bacillus megaterium son especies ubicuas frecuentes en todo tipo de suelos, sus esporas sobreviven la distribución en polvos y aerosoles siendo vehiculizadas desde estos lugares a otros hábitats como las superficies florales. Paralelamente, Bacillus megaterium junto con Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Bacillus circulans y Paenibacillus alvei son las especies predominantes en los tractos digestivos de larvas, abejas adultas y heces de las mismas. También en este capítulo, se determinó que la configuración superficial de las esporas bacterianas vistas al MEB resultó coincidente con lo descripto por otros autores para cada una de las especies analizadas. En el capítulo III se demostró que el bacteriófago PPL1c resultó una herramienta útil para la identificación y diferenciación rápida de cepas de Paenibacillus larvae, como complemento de otras características fenotípicas. El fago mostró ser altamente específico a nivel de especie encontrándose un 98 % de cepas de Paenibacillus larvae susceptibles al mismo mientras que el resto de las especies de Paenibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus y Virgibacillus resultaron resistentes. En el capítulo IV se estableció que la técnica de rep-PCR resultó adecuada para determinar la variabilidad de las poblaciones de Paenibacillus larvae dónde se halló una alta homogeneidad genética. El empleo de los cebadores BOX y REP reveló la existencia de 4 perfiles de fingerprints a los cuales denominamos A, B, C y D respectivamente, mientras que las cepas de colección pertenecientes al ex. grupo pulvifaciens mostraron el perfil distintivo E. Cuando se emplearon los cebadores ERIC, con excepción de algunas cepas provenientes de Colecciones Internacionales, todos los aislamientos obtenidos de larvas y mieles presentaron un perfil ERIC-I coincidente con lo descripto también por otros investigadores y sólo se halló el perfil ERIC-II en cepas pigmentadas enviadas de la Colección del SAG. Mientras que el perfil ERIC-I es el de mayor distribución a nivel mundial, el perfil ERIC-II ha sido citado en Alemania, Finlandia, Suecia y Austria y, muy recientemente, en muestras de Canadá y Nueva Zelanda. Las cepas pertenecientes al perfil ERIC I estudiadas en esta tesis a su vez se subdividían en alguno de los 4 perfiles BOX (A, B, C o D) y presentaban colonias "típicas" de Paenibacillus larvae no pigmentadas, de color entre blanquecino y grisáceo y formas ligeramente rugosas en agar MYPGP y en agar Columbia suplementado con sangre ovina (Capítulo II). Por otra parte las cepas de colección del grupo ex pulvifaciens, analizadas aquí (n=5) presentaron un perfil ERIC–IV / BOX-E. Si bien en este trabajo no se encontró ningún representante del genotipo ERIC-II, a excepción de los cultivos enviados por el SAG, el mismo pudo haber pasado inadvertido en el análisis de mieles debido a la alta contaminación de las mismas con otras especies esporuladas Gram (+) que hizo imprescindible someter a las muestras a un shock térmico previo al aislamiento en medios semi-selectivos. En el capítulo IV también se concluyó que el gen 16S rRNA es polimórfico entre las especies esporuladas aerobicas comúnmente presentes en la miel, no obstante, no se detectaron polimorfismos a nivel intra-especie en las cepas de Paenibacillus larvae de distintas regiones geográficas cuando se emplearon las endonucleasas (Alu I, Msp I, Hae III, CfoI, Rsa I y Taq I). En cuanto a las comparaciones entre perfiles de rep-PCR y RFLP se observó que los 4 patrones de BOX-PCR observados (A, B, C y D) y los fingerprints ERIC-I y ERIC-II se correlacionaron con el perfil A obtenido por HaeIII, mientras que las cepas de colección que mostraron un perfil BOX-E y un perfil ERIC-IV se correlacionaron con el perfil B obtenido con la endonucleasa HaeIII. Lo mismo ocurrió con la enzima HinfI dónde las cepas pertenecientes a los perfiles ERIC-III y BOX-E mostraron un patrón B y las cepas con perfiles ERIC-I o ERIC-II y BOX-A, BOX-B, BOX-Cy BOX-D no presentaron un sitio de corte con esta endonucleasa. En el capítulo V se seleccionó un subconjunto de aislamientos de Paenibacillus larvae de distintos orígenes geográficos y perfiles de fingerprints para determinar la sensibilidad/ resistencia a tetraciclina y oxitetraciclina mediante las técnicas de CIM y de difusión en agar. La distribución de la sensibilidad por CIMs de la población bacteriana analizada varió entre 0,062 y 128 µg/ml de Tc sugiriendo una distribución bimodal con dos sub-poblaciones que claramente difirieron en su sensibilidad, con 76% de cepas S (CIM entre 0,062 y 2 µg/ml) y 24 % de cepas dentro del rango de la zona I y R. Las cepas I provenían en su mayoría de Argentina y las S cuyos valores de CIM resultaron los más bajos, de países europeos, lo cual es esperable dado que en casi toda la UE está prohibido el uso de antibióticos en apicultura, mientras que en países como EE.UU., Canadá y Argentina, entre otros, es usual el empleo de OTC para el control de loque americana en las colmenas afectadas. Al comparar las CIM obtenidas por E-test con las obtenidas por dilución en agar, en el caso de agar Iso-Sensi Test hubo concordancia de categoría del 100 %, encontrándose la misma proporción de cepas susceptibles y resistentes que por la técnica de dilución en agar; pero al emplear MYPGP hubo concordancia de categoría del 81,81 %. Se concluye entonces que la combinación de las tiras de E-Test con el agar ISO-Sensi Test representa una alternativa válida para determinar las CIM de tetraciclina en cepas de Paenibacillus larvae. Es importante destacar que todas las cepas de Paenibacillus larvae ensayadas mostraron un desarrollo confluente en Iso-Sensi test, el cual podría usarse también como medio alternativo para el desarrollo de las células vegetativas de este patógeno. Se obtuvieron las secuencias completas de los plásmidos pPL373, pPL374 y pPL395. Dichas secuencias se depositaron en el GenBank con los números de acceso KF 433938 para pPL373, KF 536616 para pPL374 y KF440690 para pPL395, provenientes de las cepas PL373, PL374 y PL395, respectivamente que presentaban resistencia a Tc y OTC. Hemos demostrado experimentalmente la transferencia del plásmido pPL374 en la cepa de Bacillus subtilis m351 y del plásmido pPL373 en la cepa de Bacillus subtilis GSY1104 mediante conjugaciones en medio líquido. Al examinar ambas cepas dadoras de Paenibacillus larvae PL373 y PL374 mediante la técnica de lisis in situ se observaron dos plásmidos de aproximadamente 5.000 bp y 8.000 bp, pero sólo el plásmido más pequeño era el que contenía el gen de resistencia a Tc. Luego de efectuar la secuenciación completa de los plásmidos más pequeños obtenidos de las cepas pPL373 y pPL374, respectivamente confirmamos que el gen de resistencia es el tetL y no el tetK como creímos en un principio y que ambos replican por el mecanismo de círculo rodante encontrado en pequeños plásmidos movilizables de alto número de copias presentes en bacterias Gram (+). Todos los experimentos de movilización por conjugación empleando la cepa PL395 que contiene un único plásmido de 5.000 bp denominado pPL395 resultaron infructuosos, no obstante el ADN plasmídico obtenido de la cepa PL395 si pudo transferirse por electroporación a una cepa de Paenibacillus larvae TcS. Los plásmidos pPL373 y pPL374 también pudieron transferirse por electroporación a la misma cepa de Paenibacillus larvae TcS. En todos los casos los plásmidos se mantuvieron en forma estable en sus respectivos aceptores. Los plásmidos más grandes contenidos en las cepas PL373 y PL374, podrían codificar para funciones conjugativas y, al coexistir en la misma cepa bacteriana aportarían a los plásmidos movilizables pPL373 y pPL374 las funciones conjugativas necesarias para su movilización por conjugación; por lo que se justifica estudiarlos en profundidad y secuenciarlos para clarificar los mecanismos de transmisión plasmídica de Paenibacillus larvae en la naturaleza. La presencia de plásmidos con secuencias muy similares aislados de bacterias Gram (+) provenientes de distintas zonas geográficas y de distintos nichos ecológicos (suelo, hábitats marinos, alimentos) de los géneros Bacillus, Paenibacillus, Sporosarcina, Lactobacillus y Bhargavaea nos sugieren que los genes mob presentes en dichos plásmidos pueden estar involucrados en una exitosa THG. El uso extensivo de Tc y OTC para el control de loque americana en algunos países de América pudo haber contribuido al incremento del número de cepas resistentes de Paenibacillus larvae, favoreciendo la transferencia de estos plásmidos entre cepas del mismo patógeno o desde o hacia otras especies de bacterias Gram (+) de los géneros Lactobacillus, Bacillus y Paenibacillus que pertenecen a la microbiota de la colmena (miel, tractos digestivos de abejas adultas y larvas, superficies florales y polen). El uso prolongado de tetraciclina en las colmenas afectadas por loque americana y otras enfermedades bacterianas estaría favoreciendo la ocurrencia de eventos de transferencia genética horizontal como se demostró en cepas del patógeno provenientes de EE.UU.