Desarrollo y validación intralaboratorio de una metodología para la detección y aislamiento de <i>Escherichia coli</i> productor de toxina shiga en carne bovina molida

Abstract

Escherchia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno asociado a ETA y la carne molida es uno de los alimentos involucrados en su transmisión. El objetivo del trabajo fue disminuir la contaminación con STEC en la carne bovina molida destinada a consumo minorista. El trabajo se desarrollo en tres etapas: 1) evaluación de diferentes medios de cultivo para el enriquecimiento y aislamiento de STEC en carne bovina molida, 2) desarrollo y validación de dos técnicas de tamizaje para la detección de los genes stx a partir del caldo de enriquecimiento, y 3) implementación de estrategias de mejora a nivel de boca de expendio minorista utilizando la metodología validada como herramienta analítica de verificación. Se identificó la combinación más efectiva entre cuatro caldos de enriquecimiento selectivo y tres agares de cultivo para el aislamiento de todos los serogrupos de STEC en carne bovina molida. El enriquecimiento en caldo tripticasa de soya con 8 mg L-1 de novobiocina y en caldo Escherichia coli modificado seguidos por el aislamiento en agar MacConkey fueron las combinaciones más efectivas. Se desarrollaron y validaron dos PCR SYBR Green y una PCR tiempo real múltiple para la detección de los genes stx1 y stx2. Todas las PCR obtuvieron un límite de detección de 1×102 UFC mL-1 y 100% de inclusividad y exclusividad. La metodología validada fue utilizada para determinar la frecuencia de STEC en carne bovina molida y ambiente de las carnicerías de Berisso, como instrumento para mejorar su calidad higiénico-sanitaria. El trabajo se desarrollo en tres etapas: I) 2010-2011: se cuantificó el riesgo en 110 carnicerías, 55 (50,0%) presentaron riesgo alto, 43 (39,0%) riesgo moderado y 12 (11%) riesgo bajo. II) 2012: se diseñó e implementó un plan de acciones de mejora para las 110 carnicerías y 500 carniceros. Se capacitaron los docentes de los 26 jardines de infantes de Berisso y se entregó información a 4506 niños de 3 a 5 años. III) 2013: Se verificó el éxito de las acciones de mejora en 86 carnicerías, de las cuales 19 (22,1%) presentaron riesgo alto, 42 (48,8%) riesgo moderado y 25 (29,1%) riesgo bajo. Al comparar los resultados de la primera etapa de muestreo (2010-2011) y la verificación (2013) se demostraron diferencias altamente significativas (P<0.01) respecto de las carnicerías cuantificadas de riesgo alto y bajo, y de muestras positivas al tamizaje para STEC O157 y no-O157. Se aislaron 25 cepas de STEC O157:H7, 20 en la etapa I y 5 en la etapa II, las cuales fueron portadoras de los genes rfbO157/stx2/eae/ehxA/fliCH7/efa/toxB/iha, y 14 pertenecieron al clado 8. Por PFGE-XbaI se demostró que en la etapa I la presencia de STEC en el ambiente estaba asociada a la contaminación de la carne. Entre las 79 cepas de STEC no-O157 los serotipos más frecuentes fueron O178:H19, O8:H19, O174:H28, ONT:H7 y ONT:H19. Por PFGE-XbaI fue posible demostrar que los clones circulantes en varias carnicerías antes de aplicar las acciones de mejora tenían una variable en común: el origen de la carne. El conocimiento adquirido permitió 1) diseñar y promover acciones de mejora con base en cuantificación de riesgo y resultados analíticos, 2) mejorar la calidad de la carne bovina molida a nivel de boca de expendio con el fin de reducir el impacto de las ETA en los consumidores, y 3) marcar un precedente para el resto de los locales expendedores de alimentos de Berisso y otros municipios de la Argentina.