Caracterización de especies fitopatógenas de <i>Pythium</i> y <i>Phytophthora</i> (Peronospromycetes) en cultivos ornamentales del cinturón verde La Plata-Buenos Aires y otras áreas y cultivos de interés

Abstract

La diversidad de especies de Pythium y de Phytophthora conocidas en el mundo y los escasos estudios referidos a éstas, efectuados en la región del Cinturón verde La Plata-Buenos Aires, permiten inferir la existencia de enfermedades de las plantas aún no diagnosticadas y la presencia de una mayor diversidad de patógenos no citados en el país, que estarían afectando los cultivos de esa región. Frente a este planteo se propuso el presente estudio con los objetivos de actualizar el estado del conocimiento sobre estos géneros y realizar una prospección de las enfermedades presentes en la región, identificando las nuevas patologías y relaciones hospedante-patógeno, y confirmando la presencia de las previamente citadas. A efectos de recopilar, organizar y actualizar la información referida a especies fitopatógenas de estos géneros en la Argentina, se efectuó una exhaustiva revisión de antecedentes desde finales del siglo XIX hasta el año 2014. En el período 2009-2012 se llevó a cabo una prospección de las enfermedades ocasionadas por Pythium y por Phytophthora en cultivos intensivos ornamentales en algunas localidades del Cinturón verde bonaerense. Además, con la finalidad de identificar la mayor cantidad de especies que permitiera una caracterización más completa de la región, se incluyeron aislamientos de Pythium sin identificación específica y de especies de Phytophthora identificadas sólo por sus características morfobiométricas y culturales, coleccionadas en el CIDEFI-UNLP (Ing. Wolcan), obtenidas en cultivos de La Plata y alrededores, entre los años 2000-2008. Se amplió el presente estudio identificando y caracterizando aislamientos provenientes de otras áreas y cultivos de interés económico, correspondientes a muestras recibidas en los Servicios de Diagnóstico del CIDEFI-UNLP (Ing. Wolcan) y el LASAVE-FAUBA (Ing. Palmucci). Las especies de Pythium y de Phytophthora fueron descriptas y caracterizadas mediante el estudio de sus caracteres culturales, morfológicos y biométricos (estructuras vegetativas y estructuras reproductivas sexuales y asexuales), las temperaturas cardinales y el crecimiento medio. Las identificaciones se complementaron con estudios moleculares y de secuenciación y en algunos casos se obtuvo su ubicación filogenética. Los estudios moleculares se efectuaron en el Molecular Diagnostics Laboratory-USDA, Belstville, USA, bajo la supervisión de la Dra Gloria Abad. El ADN de las muestras fue extraído de cultivos puros desarrollados en APG, utilizando un kit comercial. La región ITS del rADN nuclear se amplificó usando los primers ITS4 e ITS5, se secuenció (Mc Lab, San Francisco, USA) y comparó con el banco de genes del servidor BLAST-NCBI y del Phytophthora Database. Todas las comparaciones en el GenBank-Blast y la construcción de árboles filogenéticos, se efectuaron considerándose las secuencias de las especies tipo, holotipo o extipo. Para comprobar la patogenicidad se inocularon plantas de la misma especie a temperatura y humedad controladas. La información obtenida en la revisión de antecedentes fue categorizada y presentada en Tablas y Figuras. Este ordenamiento permitió actualizar el status o inventario de las especies de Pythium y de Phytophthora presentes en el país, considerando los cambios en su sistemática que se produjeron en los últimos años, y acceder en forma rápida y comparada a la información referida a diferentes aspectos de estos patógenos (rango de hospedantes, primera cita en el país, síntomas, localización geográfica, especies por región, por tipo de cultivo y por provincia, estudios moleculares realizados en el país). Como resultado de la prospección efectuada se hallaron nuevas enfermedades afectando cultivos de producción intensiva en el área de estudio, ocasionando damping off, podredumbre de raíces, podredumbre basal, podredumbre de la corona, podredumbre de frutos y de cladodios. Se identificaron 10 especies de Pythium (P. aphanidermatum, P. cylindrosporum, P. dissotocum, P. graminicola, P. intermedium, P. irregulare, P. spinosum, P. splendens, P. sylvaticum, P. ultimum var. ultimum, P. ultimum var. sporangiiferum y 2 Pythium sp. nov.), y 5 especies de Phytophthora (Ph. capsici, Ph. cinnamomi, Ph. cryptogea, Ph. nicotianae, Ph. taxon kelmania), 1 Ph. aff. cryptogea. Las especies de Pythium provenientes de la prospección, de otras áreas de interés y de las colecciones, se hallaron asociadas a los siguientes hospedantes: P. aphanidermatum-Euphorbia pulcherrima, Nicotiana tabacum y Spinacea oleracea; P. cylindrosporum-Eustoma grandiflorum; P. dissotocum-Nicotiana tabacum; P. graminicola-Pennisetum clandestinum; P. intermedium-Impatiens x hawkerii y Spathiphillum wallisii; Pythium irregulare-Primula obconica, Impatiens walleriana y Scindapsus aureus; P. spinosum-Hebe sp.; P. splendens-Rhododendon indicum; P. sylvaticum-Cyclamen persicum y Lavandula angustifolia; P. ultimum var. ultimum-Actinidia deliciosa, Dianthus caryophillus, Gazania repens, Euphorbia pulcherima y Ocimum basilicum y P. ultimum var. sporangiiferum-Polygala myrtifolia. Dos nuevas especies de Pythium, con las que se comenzaron los estudios para llegar a su descripción, fueron halladas afectando Capsicum annuum y Schlumbergera truncata. Se registraron por primera vez en el país a P. cylindrosporum, P. sylvaticum y P. splendens. Es la primera cita en el mundo de P. cylindrosporum afectando C. persicum y de P. sylvaticum a Eustoma grandiflorum. Para el género Pythium se aplicó por primera vez el uso del análisis de secuencias (BLAST y Filogenia). Para Phytophthora las asociaciones halladas fueron: Ph. capsici-Capsicum annuum, Cucurbita moschata; Ph. cinnamomi-Actinidia deliciosa, Casuarina cunninghamiana, Vaccinium corymbosum, y Rhododendrom indicum; Ph. cryptogea-Gerbera jamesonii; P. taxon kelmania-Gerbera jamesonii, Gypsophila paniculata y Actinidia deliciosa; y Ph. nicotianae-Dieffenbachia picta, Catharanthus roseus, Primula obconica, Chamelaucium uncinatum, Gypsophila paniculata, Schlumbergera truncata y Hebe speciosa. Si bien algunas de estas relaciones huésped-patógeno ya eran conocidas en el país se aplicaron por primera vez las técnicas moleculares y de secuenciación para confirmar la identidad específica de Ph. nicotianae como agente causal de Podredumbre basal de Chamelaucium uncinatum, Gypsophilla paniculata y de Catharanthus roseus. Este es el primer registro de Ph. nicotianae como causante de Podredumbre de tallo y raíces de Dieffenbachia picta en Argentina y en América del Sur y de Podredumbre basal en Primula obconica, Hebe speciosa y Schlumbergera truncata. Se cita por primera vez en la región en estudio a Ph. cinnamomi afectando kiwi y azalea, y a casuarina en Concordia (Entre Ríos). La caracterización morfológica de los aislamientos, unida a los resultados de las técnicas moleculares, permitieron diferenciar entre Ph. cryptogea y Ph. taxon kelmania e incluir a esta última especie como patógeno de Gerbera jamensonii, Gypshophilla paniculata y Actinidia deliciosa. Ph. taxon kelmania ZG Abad & Abad JA, es una nueva especie, citada por primera vez en Argentina y en el mundo sobre G. paniculata y A. deliciosa. De raíces de Rhododendron indicum se aisló a Phytopythium chamaehyphon. Es el primer reporte en el país, del género Phytopythium y de la mencionada especie. Se confirmó la patogenicidad de todos los aislamientos, cumpliéndose los Postulados de Koch. Se estudiaron 41 relaciones hospedante-patógeno, en 29 hospedantes diferentes, de las cuales 30 fueron citadas por primera vez en el país, correspondiendo 32 a nuevas enfermedades citadas en el Cinturón verde La Plata-Buenos Aires (22 de Pythium, 9 de Phytophthora y 1 de Phytopythium). Se deberá continuar el estudio de las dos especies nuevas de Pythium, ampliando su caracterización morfológica y de rango de hospedantes y efectuando estudios moleculares y de secuenciación del rADN, utilizando otros marcadores. Los resultados del presente relevamiento en la región, las identificaciones realizadas sobre los aislamientos asociados a las patologías halladas en otros sitios de interés, y la identificación específica de las cepas de colección, han significado un aporte al conocimiento de la biodiversidad de la región del Cinturón verde La Plata-Buenos Aires, de las especies presentes en el país y de los síntomas de las enfermedades causadas por especies de Pythium y de Phytophthora en cultivos ornamentales y otros.

A large and diverse number of Pythium and Phytophthora species are known in the world; however, only a few studies concerning these were carried out in La Plata-Buenos Aires Green Belt and in the country, which allows the presumption of the existence of undiagnosed plant diseases and the presence of a greater diversity of unreported pathogens, affecting crops in the region. For this reason, a study was proposed to update the state of knowledge of these species and a survey of diseases, identifying new pathologies and host-pathogen relationships caused by species of Pythium and Phytophthora, and to confirm the presence of diseases previously reported caused by these pathogens. In order to collect, organize, and update the information on plant pathogenic species of these genera in Argentina, a revision was made of the findings registered since the late nineteenth century to mid-2014. Between 2009 and 2012 a survey was carried out of diseases caused by Pythium and Phytophthora in ornamental intensive crops in some areas of La Plata-Buenos Aires Green Belt. Furthermore, in order to identify as many species as possible that would allow a more complete characterization of the region, some isolates were included belonging to the collection of Pythium without specific identification, and Phytophthora species identified only by their morphological, biometrical and cultural characteristics, collected in CIDEFI-UNLP (Ing. Wolcan). These isolates were obtained from crops grown in La Plata and its surrounding areas, between the years 2000-2008. This study was extended to other collectible isolates from diseases caused by Pythiáceas received at the Plant Pathology Diagnostic Service at CIDEFI-UNLP-CIC (Ing. Wolcan) and LASAVE-FAUBA (Ing. Palmucci). These plants belonged to intensive or extensive crops of economic interest from other producing regions. The isolated species were identified and characterized by their cultural, morphological and biometric characters (vegetative structures and sexual and asexual reproductive structures), cardinal temperature and growth rate. The identifications were complemented with molecular and sequencing studies and in some cases their phylogenetic trees were obtained. Molecular studies were performed at the Molecular Diagnostics Laboratory-USDA, Belstville, USA under Dr Gloria Abad’s supervision. The DNA of the samples was extracted from pure cultures developing in APG, using a commercial kit. The ITS region of nuclear rDNA was amplified using primers ITS4 and ITS5. For each isolate the rDNA sequences obtained (Mc Lab, San Francisco, USA) were compared with sequences deposited at the GenBank using the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) program, in order to verify the percentage of homology with sequences of species already identified. All comparisons in the GenBank-Blast and construction of phylogenetic trees were made considering the sequences of the type species or holotype or extype. Their pathogenicity was corroborated on plants of the same species at controlled temperature and humidity. As a result of the revision all information obtained was categorized and presented in Tables and Figures. This allowed the update of status or inventory of each species of Pythium or Phytophtora present in the country, considering the changes that occurred in recent years, and a quick and comparative access to information on different aspects related to these pathologies (host range, first record in the country, symptoms, geographic location, species by region, by type of crop, by province and molecular studies in the country). After the completed survey new diseases were found affecting intensive production crops in the study area, causing damping off, root rot, collar rot, crown rot, rotting fruits and cladodes. Ten species of Pythium (P. aphanidermatum, P. cylindrosporum, P. dissotocum, P. graminicola, P. intermedium, P. irregulare, P. spinosum, P. splendens, P. sylvaticum, P. ultimum var ultimum, P. ultimum var. sporangiiferum) five species of Phytophthora (Ph. capsici, Ph. cinnamomi, Ph. cryptogea, Ph. nicotianae, Ph. taxon kelmania) and 1 Ph. aff. cryptogea were identified. Pythium species from prospecting, other areas of interest and collections were found associated to the following hosts: P. aphanidermatum-Euphorbia pulcherrima, Nicotiana tabacum and Spinacea oleracea; P. cylindrosporum-Eustoma grandiflorum; P. dissotocum-Nicotiana tabacum; P. graminicola-Pennisetum clandestinum; P. intermedium-Impatiens x hawkerii and Spathiphillum wallisii; Pythium irregulare-Primula obconica, Impatiens walleriana and Scindapsus aureus; P. spinosum-Hebe sp.; P. splendens-Rhododendon indicum; P. sylvaticum-Cyclamen persicum and Lavandula angustifolia; P. ultimum var. ultimum-Actinidia deliciosa, Dianthus caryophillus, Gazania repens, Euphorbia pulcherima and Ocimum basilicum and P. ultimum var. sporangiiferum-Polygala myrtifolia. Two new species of Pythium were found to affect Capsicum annum and Schlumbergera truncata. P. cylindrosporum, P. sylvaticum and P. splendens were recorded for the first time in Argentina. It is the first cite in the world of P. cylindrosporum on C. persicum and P. sylvaticum on Eustoma grandiflorum. The use of the sequence analysis was applied for the first time for the identification of Pythium species in Argentina For Phytophthora the relationships were: Ph. capsici- Capsicum annuum; Ph. cinnamomi- Actinidia deliciosa, Casuarina cunninghamiana, Vaccinium corymbosum, and Rhododendrom indicum; Ph. cryptogea-Gerbera jamesonii; Ph. taxon kelmania-Gerbera jamesonii, Gypsophila paniculata and Actinidia deliciosa; and Ph. nicotianae-Dieffenbachia picta, Catharanthus roseus, Primula obconica, Chamelaucium uncinatum, Gypsophila paniculata, Schlumbergera truncata and Hebe speciosa. Although some of the host-pathogen relationships were already known in the country, for Phytophthora spp. molecular methodology and sequencing was first applied to confirm the identity of pathogens Ph. nicotianae as causal agent of Basal rot of Chamelaucium uncinatum, Gypsophilla paniculata and Catharanthus roseus. Stem and root rot of Dieffenbachia picta caused by Ph. nicotianae were reported for the first time in Argentina and South América and Basal rot in Primula obconica in Argentina. Ph. cinnamomi is cited for the first time affecting kiwi and azalea in the region under study, and casuarina in Concordia (Entre Ríos).The morphological characterization of the isolates and the results of molecular techniques made it possible to differentiate between Ph. cryptogea and Ph. taxon kelmania and include Ph. taxon kelmania as a pathogen of Gerbera jamensonii, Gypshophilla paniculata and Actinidia deliciosa. Ph. taxon kelmania ZG Abad Abad & JA, is a new species, cited for the first time in Argentina and the world ever on gypsophila and kiwi. Phytopythium chamaehyphon was isolated from Rhododendron indicum roots. It is the first report in the country of the genus and the species Phytopythium chamaehyphon. Pathogenicity of all isolates was confirmed, fulfilling Koch´s postulates. (Forty one) 41 host-pathogen relationships in 29 different hosts were studied, 30 of which were new diseases mentioned in the country and 32 in the region (22 Pythium, 9 Phytophthora and 1 Phytopythium). The study of new species must continue, enlarging their morphological and host range characterization; and further molecular and rDNA sequencing studies must be carried out, using other markers. This survey, the identifications made on the pathologies found in other sites of interest, and the specific identification of the collection strains have meant a contribution to the knowledge of the biodiversity of the region's Green belt La Plata-Buenos Aires, the species present in the country and symptoms of diseases caused by Pythium spp. and Phytophthora in ornamental species and others.