Terapia génica y reprogramación celular en modelos animales de envejecimiento cerebral

Abstract

En humanos y ratas, el envejecimiento está asociado a un progresivo deterioro del aprendizaje y la memoria espacial. Además, el envejecimiento trae aparejado cambios morfométricos en el hipocampo, una estructura clave en la formación y consolidación de la memoria. Uno de estos cambios es una reducción dramática de la neurogénesis en la región del Giro Dentado. La rata senil presenta cambios similares al humano en la morfometría de su hipocampo y, además, tiene un desempeño inferior al de la rata joven en pruebas de memoria espacial; por lo tanto, es un excelente modelo de investigación básica para desarrollar terapias novedosas contra el deterioro cognitivo asociado al envejecimiento. Previamente en nuestro laboratorio se puso a punto la metodología del estudio de la memoria espacial en ratas mediante el Laberinto de Barnes. En este trabajo de tesis estudiamos en mayor profundidad el impacto que tienen protocolos de variada intensidad sobre la habituación comportamental en nuestra colonia de ratas y descubrimos que la memoria espacial puede ser evaluada hasta un máximo de tres veces, tiempo después del cual los sujetos se habitúan a la tarea. Además, luego de poner a punto la tinción de Golgi, descubrimos que el mero hecho de estar expuestas al test cognitivo por tres meses indujo en las ratas un incremento en la densidad de espinas dendríticas de neuronas del hipocampo. Habiendo sentado las bases para el protocolo del Laberinto de Barnes para la evaluación de la memoria espacial en nuestra colonia de ratas, nos dispusimos a estudiar las diferencias comportamentales entre ratas jóvenes y seniles. Encontramos que las ratas seniles presentan un desempeño muy pobre en comparación con las jóvenes en el paradigma del Laberinto de Barnes. Luego nos preguntamos si este deterioro cognitivo tendría su correlato a nivel morfométrico y molecular en el hipocampo. En este sentido encontramos que el hipocampo senil presenta una dramática reducción en la tasa de neurogénesis, evaluada por inmunomarcación para Doblecortina. Además, encontramos una elevada infiltración de células microgliales en el hipocampo. En aras de investigar las vías biológicas del hipocampo asociadas al envejecimiento, realizamos secuenciamiento de ARN para análisis de expresión génica diferencial entre hipocampo joven y senil. Esto nos permitió descubrir que en el hipocampo senil están exacerbadas las vías de la respuesta inflamatoria, lo cual corroboró nuestra observación microscópica de infiltrados microgliales. Además, descubrimos una impronta transcriptómica conservada en humanos de 11 genes sobreexpresados en el hipocampo senil. Estos estarían implicados en una función biológica común que promueva una reacción inflamatoria exacerbada en el envejecimiento. Este último hallazgo dio lugar a nuevas líneas de investigación en nuestro laboratorio, entre ellas el rol de la proteina Tyrobp en la respuesta microglial frente a fenómenos de envejecimiento cerebral y gliomas de diverso grado. Los niveles cerebrales del Factor de Crecimiento Insulino Símil 1 (IGF-I) caen con el envejecimiento. Por lo tanto, el IGF-I emerge como una molécula neuroprotectora de especial interés para la implementación de terapia génica de sobreexpresión. Por lo tanto, para este trabajo realizamos dos estudios de terapia génica con IGF-I en ratas seniles: uno de corto y otro de largo plazo. En nuestro experimento de corto plazo realizamos un protocolo corto de entrenamiento en el Laberinto de Barnes y encontramos que, dos semanas después de la terapia, ratas de 28 meses tuvieron mayor precisión de memoria espacial, así como un aumento en su recuento de neuronas inmaduras inmunomarcadas para Doblecortina en el hipocampo. Además, un análisis microscópico de células astrogliales inmunarcadas para Proteina Glial Fibrilar Ácida nos permitió observar que la terapia estimuló un incremento en la arborescencia proximal en las prolongaciones de astrocitos hipocampales. En nuestro experimento de terapia génica con IGF-I de largo plazo, realizamos sobre ratas de 24 meses un protocolo de test de comportamiento más extenso y observamos un rendimiento superior debido a la terapia cuando las ratas cumplieron 28 meses, lo cual sugiere que la efectividad de la terapia es mayor cuanto más avanzado está el envejecimiento. El análisis del transcriptoma reveló que la terapia génica estimuló la sobreexpresión de genes relacionados a actividad sináptica, a las vías de señalización del IGF-I y a la neurogénesis. Entre este último grupo de genes se encontró que la terapia génica indujo sobreexpresión de Doblecortina, lo cual respaldó nuestro experimento de corto plazo. Este trabajo ha sentado las bases para evaluar la memoria espacial en ratas jóvenes y viejas mediante el Laberinto de Barnes, además hemos demostrado la efectividad de la terapia génica con IGF-I para tratar el déficit cognitivo relacionado a la edad. Por otra parte, se han generado nuevas líneas de investigación de acuerdo a nuestros hallazgos de cambios transcriptomales del hipocampo asociados al envejecimiento. Finalmente, se discuten para abordarse en el futuro terapias génicas con vectores bicistrónicos codificantes para IGF-I y marcadores fluorescentes así como terapias celulares novedosas para mejorar el déficit cognitivo mediante las tecnologías de reprogramación celular seguidas de transplante.