Estudios sobre la transferencia horizontal de resistencia a tetraciclina en bacterias esporuladas aisladas de colmenas de abejas melíferas

Abstract

La miel es un alimento natural elaborado por las abejas melíferas y como tal, presenta una microbiota propia al igual que el resto de los alimentos. Las especies bacterianas formadoras de esporas de los géneros Bacillus y Paenibacillus aparecen en forma frecuente, y, dentro de ellas, se cita Bacillus cereus sensu stricto que está asociada a procesos infecciosos humanos como productora de enterotoxinas. En la miel también pueden encontrarse bacterias causantes de enfermedades de las abejas como la loque americana, ocasionada por Paenibacillus larvae, y la loque europea, producida por Melissococcus plutonius. Durante muchos años, estas enfermedades se trataron con el antibiótico oxitetraciclina, generando la aparición de resistencia de los agentes microbianos que se querían controlar con la consiguiente aplicación de dosis cada vez mayores, y la contaminación de la miel con residuos de estas sustancias. El aumento de la prevalencia de la resistencia antimicrobiana en bacterias patógenas, es el resultado de la evolución y la presión selectiva debido a la amplia implementación del uso de antibióticos en medicina humana, medicina veterinaria, alimentación animal y agricultura. Esta adaptación ocurre, no por la mutación de las poblaciones amenazadas, sino mayormente por la adquisición y diseminación de genes simples de resistencia a antibióticos mediante elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y transposones. Estos elementos móviles distribuyen eficientemente los determinantes de resistencia a antibióticos, individualmente o en grupos, entre muchos géneros y especies bacterianas. En el caso de las tetraciclinas, la resistencia se debe a la adquisión de genes tet (tetraciclina) y otr (oxitetraciclina); frecuentemente estos genes están asociados con plásmidos y/o transposones conjugativos. Con el objetivo de investigar la presencia de determinantes de resistencia a tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina en cepas de B. cereus y P. larvae aisladas de miel y materiales del apiario y su correlación con la presencia de plásmidos salvajes se aplicaron procedimientos de microbiología y biología molecular. Se analizó la presencia de los determinantes de resistencia a tetraciclina: Tet K, Tet L, Tet M, Tet O, Tet Q, Tet S, Tet A (P) y Otr A y se observó una alta correlación entre la presencia de plásmidos y fenotipos resistentes a tetraciclina. Mediante PCR, se detectó la presencia del determinante Tet L empleando como molde ADN plasmídico en un 76% de las cepas de B. cereus estudiadas y del determinante Tet M en la cepa B. cereus m383 con fenotipo resistente a tetraciclina, oxitetraciclina y minociclina cuando se utilizó como molde ADN genómico total, pero no así cuando se utilizó ADN plasmídico. Con respecto al resto de los determinantes de resistencia analizados (Tet K, Tet O, Tet Q, Tet S, Tet A (P) y Otr A), no se observó producto de amplificación alguno en las cepas estudiadas, ni en ADN genómico total ni en ADN plasmídico. Se realizaron ensayos de conjugación entre cepas resistentes y sensibles, y de transformación por electroporación con ADN plasmídico obtenido de cepas resistentes, demostrando una transferencia horizontal de genes de resistencia a tetraciclina entre la cepa de B. cereus m401, resistente a tetraciclina, y las cepas de B. cereus ATCC 11778 NALR y B. pumilus m350 NALR, sensibles a tetraciclina. Se obtuvieron transconjugantes con fenotipo resistentes a tetraciclina para ambas cepas aceptoras, pero no se obtuvieron transformantes en los ensayos de electroporación. Mediante el análisis de los resultados de la secuenciación del genoma completo de la cepa de B. cereus m401 se confirmó la presencia de 3 plásmidos, a los cuales denominamos pBCm401a, pBCm401b y pBCm401, de 8.307 pb, 9.934 pb y 69.591 pb, respectivamente. Luego del análisis de las anotaciones funcionales de los genes codificantes de proteínas obtenidos en estos 3 plásmidos no se encontraron genes que codifiquen funciones relacionadas con resistencia a tetraciclina. Al no encontrar en ninguno de los tres plásmidos genes que codifiquen resistencia a tetraciclina, se efectuó la búsqueda de dichos genes en el resto de los contigs obtenidos del genoma (n=46). Luego del análisis de las anotaciones funcionales se detectó un contig (contig09) de 243.988 pb conteniendo un gen de resistencia a tetraciclina de 1.377 pb (contig09_orf00135) con alta homología a los genes tetK, tetL y tet45, que codifican para proteínas de eflujo. Según el análisis efectuado en la base de datos del servidor GenBank mediante la herramienta BLASTn, este contig se correspondería con secuencias similares pertenecientes a megaplásmidos de B. cereus y B. thuringiensis. Los resultados del análisis del alineamiento de la secuencia correspondiente al gen de resistencia a tetraciclina presente en el contig09 con secuencias correspondientes a los genes de resistencia tetK, tetL y tet45 permitieron concluir que el gen de resistencia a tetraciclina presente en la cepa m401 se correspondería con el gen tet45, ya que muestra mayor homología (93%) con la secuencia de dicho gen, con respecto a los genes tetL (80%) y tetK (64%). Por todo lo expuesto, se puede concluir que este trabajo es el primer registro de la presencia del gen de resistencia tet45 en un posible megaplásmido de B. cereus.