Diagnóstico de leptospirosis canina mediante una técnica de PCR en tiempo real

Abstract

La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial causada por bacterias del género Leptospira que afecta a numerosas especies de animales domésticos y silvestres. El diagnóstico en caninos se realiza demostrando seroconversión en muestras del paciente en el periodo agudo y convaleciente de la enfermedad mediante la prueba de microaglutinación (MAT) no obstante, la aplicación de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede proporcionar una confirmación temprana de los casos sospechosos. El objetivo de este trabajo fue validar en una etapa intralaboratorio una técnica de PCR en tiempo real (qPCR) que utiliza cebadores dirigidos a un fragmento del gen lipL32 (lipL32-qPCR). Posteriormente se evaluó su utilidad en el diagnóstico, a partir de muestras clínicas de caninos con sospecha de la enfermedad tomando, como referencia la prueba de MAT. La sensibilidad analítica a partir del ADN de cepas de referencia fue de 1 x 100 equivalente genoma/reacción. Al evaluar la especificidad analítica, todas las cepas patógenas fueron correctamente amplificadas mientras que con el ADN de 2 cepas saprófitas y otros microorganismos se obtuvieron resultados negativos. En muestras biológicas contaminadas experimentalmente la sensibilidad analítica fue de 1 x 102 bacterias/ml en sangre, 1 x 103 bacterias/ml en suero y 1 x 101 bacterias/ml en orina. La técnica lipL32- qPCR demostró mayor sensibilidad analítica a partir del ADN de cepas de referencia y de las muestras de sangre y orina contaminadas experimentalmente que una técnica de PCR convencional dirigida a un fragmento del gen rrs (rrs-PCR 2 convencional), excepto para las muestras de suero en las cuales se obtuvo el mismo valor. En el estudio a campo, se incluyeron un total de 51 caninos con sospecha clínica de la enfermedad. Con la prueba de MAT, 7 de 51 pacientes fueron considerados como casos confirmados. La técnica lipL32-qPCR fue positiva en 6 de los siete casos confirmados por MAT y permitió realizar el diagnóstico en dos pacientes seronegativos. Mientras que la técnica rrs-PCR convencional sólo detectó 4 de 7 casos confirmados. Al comparar la prueba de MAT y la lipL32-qPCR se observó una fuerte concordancia entre ambas (Kappa=0.76, 95 % IC 0.492-1.039). De acuerdo a los resultados obtenidos se concluye que la prueba lipL32-qPCR resulta un excelente complemento de la serología en la confirmación de casos sospechosos y permite diagnosticar un mayor porcentaje de caninos verdaderos positivos.