Selección de aislamientos nativos de Metarhizium anisopliae como potenciales agentes de control biológico de Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)

Abstract

En este trabajo de tesis doctoral, se evaluó la efectividad del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae como agente de control biológico del mosquito Aedes aegypti, vector de diversos arbovirus. Para ello se utilizaron diferentes metodologías de aplicación de conidios y se evaluaron diferentes parámetros que reflejan la patogenicidad, virulencia y agresividad de diferentes aislamientos fúngicos. En primer lugar, se realizaron bioensayos para seleccionar cepas fúngicas nativas, preservadas en la Colección de Hongos Entomopatógenos del CEPAVE (La Plata, Buenos Aires, Argentina) (CEP 085, CEP 087, CEP 120, CEP 350, CEP 404 y CEP 423), eficaces contra adultos de Ae. aegypti. El ensayo fue realizado por aspersión directa de los conidios en suspensión sobre los insectos. Se aplicó un inóculo de cada cepa a diferentes concentraciones (5 x 106, 107, 5 x 107 y 108 conidios/ml). Durante 10 días se registró la mortalidad de los insectos y se separaron los adultos muertos para verificar la infección fúngica. Se utilizaron curvas de Kaplan-Meier para graficar la probabilidad de supervivencia de Ae. aegypti en función del tiempo para cada cepa fúngica y para cada concentración. Las diferencias entre las curvas se analizaron mediante un análisis Log-Rank y comparaciones post-hoc entre pares. Además, se determinó para cada una de las cepas fúngicas la viabilidad, la mortalidad sobre adultos de Ae. aegypti, el tiempo letal medio (TL50 y TL90) y la concentración letal media (CL50). La existencia o no de diferencias significativas entre las cepas para cada una de estas variables se determinó mediante análisis de ANOVA y comparaciones post-hoc (Tukey) en el caso de la viabilidad; mediante análisis de proporciones con aproximación Chi cuadrado y comparaciones post-hoc entre pares en el caso de la determinación de las diferencias en el porcentaje de insectos infectados y, por último, para determinar la existencia de diferencias en el TL50, TL90 y CL50 se utilizó el análisis de la superposición de los intervalos de confianza de 95%. El tiempo de supervivencia de los insectos tratados fue menor que el de los controles para todas las cepas. Se encontró un efecto significativo de la concentración del inóculo en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y en el porcentaje de individuos muertos con confirmación de la infección fúngica, para las seis cepas analizadas. Con una concentración de 5 x 107 conidios/ml, el tiempo de supervivencia de los mosquitos varió entre 4,5 (CEP 404) y 7 (CEP 087) días posteriores a la aplicación del inóculo, contra una mediana de 10 días correspondiente a los controles. El porcentaje de individuos infectados fue entre 50 (CEP 404) y 87% (CEP 423). El TL50 varió entre 6 y 7 días para todas las cepas fúngicas y no hubo diferencias significativas entre las cepas, como así tampoco en el TL90. La viabilidad fluctuó entre 82 (CEP 423) y 97% (CEP 085) con diferencias significativas entre las cepas. También se encontraron diferencias significativas en la CL50 entre las cepas. Según este último parámetro, la cepa fúngica más virulenta fue CEP 423, con una CL50 de 2,4 x 106 conidios/ml. A continuación, se procedió a inocular tres tipos de telas, de diferente coloración y composición, con el aislamiento fúngico CEP 423. Estas telas fueron luego utilizadas como sitio de reposo de los mosquitos de modo que allí fueran infectados con los conidios. Se utilizó una tela blanca de 60% algodón-40% poliéster, una roja de 100% poliéster y una negra de 100% poliéster de trama más amplia. Se evaluó el efecto del tiempo de exposición de los mosquitos a cada sustrato (6 o 24 h) y del tipo de sustrato, en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de Ae. aegypti y en la proporción de insectos infectados. También se cuantificó la persistencia en el tiempo (1, 2 o 15 días) de los conidios viables sobre cada tela. La tela blanca provocó una disminución significativa en la supervivencia respecto a los controles. El menor valor de supervivencia fue de 6,5 días con 24 h de exposición. No se encontró un efecto significativo del tiempo de exposición en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. El porcentaje de infección máximo obtenido fue de 50% con exposición de 6 h. La viabilidad de los conidios allí aplicados disminuyó desde 88 (1 día) a 22% (15 días). La tela roja provocó diferencias significativas en el tiempo de supervivencia respecto al control solo con 24 h de exposición. El tiempo de supervivencia menor fue de 9 días con 24 h de exposición. Se encontró un efecto del tiempo de exposición, aumentando significativamente el porcentaje de infección (máximo alcanzado 45%) al aumentar el tiempo de exposición. La tela de color rojo fue el sustrato en el cual la viabilidad de los conidios inoculados disminuyó menos a lo largo del tiempo (47% a los 15 días post-aplicación). La tela negra provocó diferencias en el tiempo de supervivencia respecto al control solo con 6 h de exposición. El tiempo de supervivencia menor fue de 9 días con 6 h de exposición, sin embargo, tanto el porcentaje de infección fúngica (15%) como la viabilidad (37%) de los conidios fueron bajos. En general, la persistencia de los conidios viables adheridos a estos sustratos fue dependiente del tipo de sustrato y del tiempo post-aplicación. También, fueron evaluadas la viabilidad y virulencia de M. anisopliae IP 46 (aislamiento fúngico nativo de Brasil) sometido a diferentes dosis de radiación UV-B (0-16,6 kJ m-2). Por un lado, los tratamientos consistieron en la exposición a la radiación UV-B de: i. adultos de Ae. aegypti inoculados previamente con conidios, ii. conidios sobre un medio de cultivo y iii. conidios sobre un tejido inerte. Se encontró un efecto significativo de la dosis de radiación en la viabilidad que, sobre medio de cultivo, fue completamente inhibida con dosis de radiación ≥ 8,3 kJ m-2 y retrasada con dosis de 2,1 y de 4,1 kJ m-2. Sobre un tejido inerte la viabilidad de los conidios fue retrasada pero no completamente inhibida, incluso sin encontrarse un efecto significativo de la dosis de radiación luego de 72 h de incubación. El porcentaje de mortalidad de los adultos de Ae. aegypti tratados con IP46 varió entre 43,8 y 70% luego de 15 días de tratamiento, y no se encontró un efecto significativo de la dosis de radiación en la patogenicidad. Tampoco se encontraron diferencias significativas en la conidiogénesis sobre los cadáveres. Por otro lado, se sometieron conidios a cada dosis de UV-B, en recipientes que simulaban ser sitios de cría de Ae. aegypti, bajo una columna de agua de espesor variable (0-3 cm de altura). En cuanto a la viabilidad de los conidios, se encontró un efecto significativo tanto de la dosis de radiación como del nivel de agua. En relación a la patogenicidad de IP46 contra larvas de Ae aegypti, el porcentaje de mortalidad obtenido varió entre 60 y 90% luego de 10 días de tratamiento y no se encontró un efecto significativo de la columna de agua ni de la dosis de radiación. De acuerdo a los resultados obtenidos, se destaca el potencial de la cepa CEP 423 de M. anisopliae como agente de control biológico de Ae. aegypti, debido a su virulencia. Además, el sustrato que resultó con mejores características para la aplicación indirecta de conidios fue la tela blanca ya que los conidios permanecieron viables e infectivos, al ser aplicados sobre esta superficie. Este trabajo de tesis doctoral brinda, además, conocimientos de cómo la radiación UV-B afecta la viabilidad y la patogenicidad contra Ae. aegypti de la cepa IP 46 de M. anisopliae, información de mucha utilidad a la hora de planificar la aplicación de esta cepa en futuros trabajos de campo.