Eficiencia en el uso y adquisición de fósforo en plantas de maíz y soja: participación del óxido nítrico

Abstract

El fósforo (P) es un macronutriente con funciones regulatorias y estructurales, esencial para la transferencia de energía. Bajo condiciones de escasa disponibilidad de este nutriente, las plantas responden ajustando sus caminos metabólicos a fin de reorganizar sus prioridades fisiológicas. Mejorar la adquisición y la utilización de P en cultivos es de gran interés para mantener un buen estado nutricional en las plantas y maximizar la producción de biomasa minimizando la adición de fertilizantes y el consecuente riesgo de eutroficación. El óxido nítrico (NO) participa en la modulación y señalización de un amplio rango de funciones en las plantas, incluyendo las respuestas de aclimatación a estrés biótico y abiótico. Si bien las fuentes de generación del NO en plantas todavía no han sido completamente caracterizadas, es claro que los niveles de esta especie varían en los tejidos de acuerdo a señales fisiológicas y del ambiente, y que también el NO generado en el ambiente puede difundir a los tejidos de las plantas y ejercer efectos biológicos. Con un foco en los niveles de NO como posible componente en la percepción y señalización de las plantas enfrentando deficiencias nutricionales, se avanzó en la caracterización del rol desempeñado por esta especie en algunas respuestas clásicas de las plantas de maíz al déficit de P (Capitulo 4.1) y en los cambios fisiológicos y metabólicos tempranos desencadenados en plantas de soja frente a las primeras horas de restricción de P (Capitulo 4.2). Algunas de las respuestas tempranas a la restricción de P fueron evaluadas comparativamente en soja y maíz teniendo en cuenta sus diferencias metabólicas (metabolismo C3 o C4) (Capitulo 4.3). Las plantas de maíz (Zea mays, híbrido Ax882 Cl-MG) fueron expuestas a cuatro tratamientos que combinaron dos niveles de P (0 y 0,5 mM), y dos niveles de un dador de NO, el S-nitrosoglutatión (GSNO, 0 y 0,1 mM) y se estudiaron a distintos tiempos, 6 y 21 días, las respuestas a la privación de P. Estos tiempos fueron seleccionados teniendo en cuenta que: 1) bajo las condiciones experimentales desarrolladas en este trabajo de tesis luego de 21 días de tratamiento los efectos de la deficiencia de P resultaban claramente observables en las plantas, y 2) trabajos previos que describieron respuestas fisiológicas al déficit de P cuando las plantas presentaban un 20% de restricción del crecimiento, que en nuestro sistema experimental coincidió con el día 6 de tratamiento. Los tratamientos con GSNO sobre las plantas restringidas en P, no afectaron significativamente la acumulación de P, la distribución de biomasa, el contenido de antocianinas y el filocrono, pero provocaron una reducción en la eficiencia de utilización del P (EPU) en la planta entera luego de 21 días de tratamiento. La adición de GSNO a la solución nutritiva ayudó a mantener los valores de clorofila en hojas de plantas expuestas a déficit de P pero no pudo revertir la caída del rendimiento cuántico del fotosistema II (PSII) probablemente debido a la inhibición de mecanismos del proceso fotosintético posteriores a la excitación lumínica de la clorofila, afectados por la baja disponibilidad de P. Luego de 21 días de tratamiento, la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD) en raíz no se vio afectada significativamente por el déficit de P, sin embargo, la actividad ascorbato peroxidasa (APX) se incrementó durante el mismo. El tratamiento con GSNO incrementó la actividad APX tanto en las plantas control como en las plantas sometidas a déficit de P, mientras que la actividad SOD fue significativamente reducida en ambas condiciones debido al tratamiento. La actividad de las enzimas fosfatasas ácidas en la raíz se incrementó como consecuencia de la restricción de P, y resultó fuertemente influenciada por la presencia del dador de NO, que generó un incremento de la actividad únicamente bajo condiciones de déficit de P. Las plantas de maíz expuestas durante 6 días a restricción de P generaron una fuerte caída en el pH de la solución nutritiva y un incremento en la capacidad de captar P del medio externo. La caída del pH en el medio de cultivo resultó incrementada de forma significativa en presencia del dador de NO, lo cual podría estar relacionado con mecanismos dependientes de esta especie que incrementan la extrusión de protones y/o ácidos orgánicos. El tratamiento con el dador de NO también generó un incremento sobre la capacidad de captación de P desde el medio externo en las plantas provenientes de una situación de déficit del mismo. Futuros estudios permitirán profundizar en torno a los mecanismos moleculares que relacionan al NO con estas respuestas claves de aclimatación a la deficiencia de P. Plantas de soja (Glycinemax, cv Williams 82), fueron sometidas a tratamientos de restricción total de P durante 15, 24 y 48 h. Se utilizó una aproximación Shotgun para evaluar los cambios en el proteoma de manera conjunta con la evaluación de otros procesos fisiológicos. Aunque ni los parámetros fotosintéticos ni el crecimiento fueron significativamente afectados, una caída inicial de la concentración total de P de 27% en las hojas unifoliadas luego de 24 h de restricción del nutriente llevaron a cambios en el proteoma y a modificaciones en los niveles de NO sugiriendo la existencia de cambios metabólicos tempranos inducidos durante las primeras horas de déficit. El análisis proteómico dio como resultado un total de 202 proteínas exclusivamente expresadas y 232 proteínas incrementadas en las hojas de plantas expuestas por 24 h a la restricción de P. La clasificación de las proteínas de acuerdo al consorcio Gene Ontology por su función molecular o procesos biológicos reveló un mayor porcentaje perteneciente a la categoría de actividad catalítica o procesos metabólicos respectivamente. Los resultados sugieren que el metabolismo se prepara en forma temprana para enfrentar restricciones más severas en la disponibilidad de P, con cambios metabólicos que implican el ahorro de ATP y reciclado de P, la provisión de NADPH para procesos biosintéticos, el incremento en enzimas con capacidad antioxidante, del metabolismo de carbohidratos, e involucradas en metabolismo secundario, como por ejemplo en la síntesis de flavonoides, y en la síntesis de hormonas como el etileno. Los cambios metabólicos relacionados al metabolismo de carbohidratos y destinados a mantener el balance redox en la célula parecen ser claves durante las primeras horas de restricción de P. En relación con el metabolismo del NO, tanto los niveles de esta especie como la actividad NR se vieron incrementados en condiciones de restricción de P. Adicionalmente, una isoforma de la NR fue exclusivamente expresada en las hojas de plantas sometidas a restricción de P. Los niveles de NO pueden ser consecuencia del incremento de la actividad NR, aunque otras fuentes de generación de esta especie no pueden ser descartadas. Además, el incremento en la abundancia relativa de proteínas involucradas en la síntesis de etileno sugiere una posible interacción entre el NO y el metabolismo del etileno en hojas de soja pasadas las primeras 24 h de restricción de P. Aunque los niveles de NO se vieron incrementados bajo condiciones de restricción de P, el patrón de nitración de las proteínas no resultó sustancialmente modificado en las hojas, sugiriendo que esta modificación es un proceso especifico y cuidadosamente regulado y cuyo rendimiento se encuentra afectado por multiplicidad de factores. La mayoría de las proteínas nitradas en las hojas de soja presentaron localización cloroplástica, uno de los sitios propuestos de generación de NO y ROS. Sólo una proteína resultó diferencialmente nitrada, la metionina sintasa, siendo el significado funcional de esta modificación in planta blanco de futuros estudios. Así, las plantas de soja parecen percibir la baja disponibilidad de P en forma temprana, y los cambios desencadenados sugieren el ajuste de su metabolismo para afrontar condiciones más severas de restricción al nutriente. La actividad NR y la generación de NO podrían ser mecanismos involucrados en la percepción y respuesta temprana al estrés. En los experimentos comparativos soja-maíz, las plantas crecieron en idénticas condiciones ambientales y fueron sometidas a restricción de P por un período de 24 h. El decaimiento significativo y similar en la concentración de P a tiempos cortos de restricción (24 h) en plantas de maíz y soja (hoja unifoliada en plantas de soja, hoja 2 en plantas de maíz), no impactó en los parámetros fotosintéticos (PSII y concentración de clorofila) ni en otros parámetros fisiológicos como la conductancia estomática, los cuales permanecieron estables para ambas especies. El nivel de NO en las hojas de plantas afectadas por la restricción de P resultó distinto para ambas especies, ya que las hojas unifoliadas de soja (C3), incrementaron significativamente el nivel de NO, mientras que las hojas del maíz (C4) no sólo no lo incrementaron, sino que mostraron una tendencia a disminuir el nivel de esta especie principalmente en la zona de la vaina. Las diferencias observadas para las plantas de maíz y soja coincidieron con los cambios observados en la actividad de la enzima NR permitiendo asumir que el cambio en la concentración de NO se podría deber, al menos en parte, al cambio en la actividad enzimática de la NR. La acumulación de NO en células de la vaina donde la NR está ausente, y en los cloroplastos del mesófilo en las plantas de maíz arroja interrogantes interesantes en torno a la producción de NO en ambos tipos celulares, ya sea que el NO se produzca en las células del mesofilo y se acumule en las células de la vaina o que alguna otra fuente de generación, diferente a la NR, (por ejemplo dependiente de arginina), pueda ser operativa en estas células. De esta manera es posible proponer que la generación de NO también puede estar diferencialmente localizada las hojas de maíz y que las distintas fuentes puedan verse afectadas ante situaciones de estrés, como ha sido observado previamente que ocurre, por ejemplo, con otras enzimas y antioxidantes. Futuros experimentos en torno a la generación y vías de degradación de NO en ambos tipos de células permitirán obtener una panorama más claro de las posibles vías de generación de NO involucradas y la variación en los niveles de NO. Los resultados obtenidos permiten proponer al NO como modulador de respuestas claves de aclimatación frente a la restricción de P. Los cambios tempranos en los niveles de NO sugieren una participación de esta molécula en la percepción de las modificaciones producidas en el ambiente. Si bien los mecanismos involucrados tanto en la generación de esta especie como en la participación de la misma en la modulación de las respuestas necesitan ser investigados, este trabajo de Tesis ha permitido avanzar en el conocimiento de las funciones del NO en las plantas particularmente sometidas a déficit nutricional de fósforo.