Respuestas celulares a K107del, una mutante natural de apolipoproteína A-I humana con incrementado riesgo aterogénico

Abstract

En este trabajo de Tesis se realizó la investigación exhaustiva de la mutante denominada K107del, una variante natural de apolipoproteína A-I (apoA-I) con una única deleción de la lisina en la posición 107 mediante espectrometría de masas, proteómica comparativa, y diversos estudios de interacción proteína/lípido. La apoA-I es la proteína mayoritaria de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), aunque también se encuentra en las lipoproteínas de baja densidad (LDL), y quilomicrones (CMs). Entre sus diversas funciones la principal y mejor descripta es su rol en el transporte reverso del colesterol, proceso clave para la prevención de la aterosclerosis. Desde su descubrimiento, la K107del se asoció con la predisposición a desarrollar diversas patologías en sus portadores tales como aterosclerosis temprana y severa, hipertrigliceridemia y amiloidosis. Sin embargo, hasta hoy son desconocidas las causas moleculares que generan su efecto fisiopatológico. El objetivo de este trabajo fue examinar los potenciales defectos funcionales y/o estructurales que podrían explicar la aparente disfunción de esta variante. Se caracterizó entonces a la K107del utilizando diversos métodos biofísicos y biológicos, analizando los aspectos estructurales de esta variante tanto como su función celular y su capacidad de interacción con lípidos. Para ello se realizaron experimentos de proteómica comparativa sin marca radiactiva y experimentos con lípidos modelo; asimismo se llevaron a cabo análisis estructurales utilizando el agente entrecruzante BS3, seguido de análisis por espectrometría de masas, complementados por técnicas de fluorescencia. Los resultados obtenidos demuestran que no existen diferencias significativas entre K107del y Wt en su capacidad para interaccionar con lípidos. Tampoco se observaron diferencias significativas en la capacidad de estas proteínas de modificar los niveles de expresión de proteínas celulares. Sin embargo, la K107del presenta una estructura terciaria diferente de la Wt y una menor tendencia a oligomerizar en su estado libre de lípidos. También se demostró en este trabajo, que la incubación de macrófagos humanos THP-1 con la Wt, resulta en la acumulación de la proteína multifuncional sequestosoma-1/p62 de manera dependiente de la vía antioxidante del factor nuclear eritroide-2 (vía Nrf2-Keap1). Sin embargo, aunque la incubación con K107del también resultó en la acumulación de p62, ésta lo hizo de manera independiente a la vía Nrf2. Los hallazgos presentados en esta Tesis permiten concluir que los efectos patológicos observados para la variante K107del podrían ser explicados probablemente por su conformación tridimensional alterada, tanto como su incapacidad para oligomerizar y/o su posible respuesta celular diferenciada, comparativamente a la Wt.

This work presents a comprehensive study of the mutant K107del, a natural variant of apoA-I, which has a single deletion on lysine 107. We have characterized this protein by mass spectroscopy, label-free comparative proteomics, and diverse biophysical techniques to evaluate the protein-lipids interaction. The apoA-I it’s the major protein in the high-density lipoproteins (HDL), but it is also present in low-density lipoproteins (LDL) and chylomicrons (CMs). While apoA-I is a multifunctional protein, it pivotal role in reverse cholesterol transport (RCT) it’s their most relevant function, preventing the atherosclerotic development. Since its discovery, the K107del variant has been associated with early and severe atherosclerosis, hypertriglyceridemia and amyloidosis on its carriers. However, the molecular explanation underlying it apparent misfunction remains unknown. The aim of this study was to investigate the possible structural and functional defects, suspected for this mutant. In this regard, the K107del was characterized by diverse biophysical and biological methods emphasizing on it structure and function. To this end label-free quantification proteomics, protein-lipid interaction assays, and crosslinking followed by mass spectrometry, and intrinsic fluorescence assays were performed. The outcomes shown here reflect that the deletion of lysine 107 do not impair alterations on lipids interaction nor overexpression of cellular proteins, compared to the Wt. But, third structure of K107del and it self-association capacity its profoundly altered in comparison to the Wt. Here we also demonstrated that both Wt and K107del are responsible of p62 accumulation by THP-1 macrophages until protein treatment. Thought, the p62 level due the Wt treatment was decreased by the inhibition of the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2-Keap1 pathway), this effect was not observed in case of K107del thru inhibition of this pathway. These results support the concept that probably K107del defects could be explained by it altered conformation, it defective self-association capacity, and/or it differential cellular response, in comparison to the Wt protein.