In-house standardization and validation of a multiplex RT-PCR assay for the detection of 13 respiratory viruses

Abstract

<b>Background</b>. Multiplex real time PCR is increasingly used to diagnose respiratory viruses and has shown to be superior to traditional methods, such as culture and antigen detection. <b>Objective</b>. Standardization and validation of a multiplex real-time PCR assay for the detection of 13 respiratory viruses. <b>Methods</b>. The assay was validated using RNA control targets and comparing results to single-target PCR’s. <b>Results</b>. Using RNA controls the multiplex format was found to be as sensitive and specific as the single-target PCRs, and no competition was observed between targets. The efficiencies for most of the reactions were approximately 90%, but a lower efficiency was found for Parainfluenza 2 with a rate of amplification in each cycle of 86.63%. On the other hand, a higher efficiency was observed in respiratory syncytial virus A and respiratory syncytial virus B ((93.07% each). <b>Conclusion</b>: This multiplex RT-PCR format shows an adequate efficiency, demonstrating an excellent sensitivity, specificity and repeatability for all the studied respiratory viruses.

<b>Antecedentes</b>. PRC múltiple en tiempo real es usada cada vez más para el diagnóstico de virus respiratorios y ha mostrado ser superior a métodos tradicionales, como cultivo y detección de antígeno. <b>Objetivo</b>. Estandarizar y validar una PRC múltiple en tiempo real para la detección de 13 virus respiratorios. <b>Métodos</b>. El ensayo fue realizado usando blanco de RNA control y comparando los resultados a blancos únicos de PCR. <b>Resultados</b>. Usando el RNA control, el formato de multiplex era tan sensible y específico como la PCR. Las eficiencias para la mayoría de las reacciones de aproximadamente el 90%, pero una eficiencia baja fue encontrada para influenza 2 con una tasa de amplificación en cada ciclo de 86.63%. Por otra parte, una mayor eficiencia fue observada en virus sincitial respitario A y B (93, 67% cada uno). <b>Conclusión</b>. Este formato RT-PCR múltiple muestra una adecuada eficiencia, demostrando un excelente especificidad y reproducibilidad para todos los virus respiratorios estudiados.