Producción de poligalacturonasa por Pichia anomala aislada en la provincia de Misiones

Abstract

Las enzimas pécticas microbianas son de interés en la industria de alimentos principalmente por su uso en el procesamiento de frutas y vegetales (elaboración de vinos, extracción y clarificación de jugos de frutas, extracción de aceites vegetales, maceración de vegetales, etc.). Las pectinasas constituyen un complejo sistema enzimático que incluye: pectinesterasas (PE), poligalacturonasas (PG) y pectinliasas (PL). El objetivo del presente trabajo fue estudiar la cinética de producción de PG por Pichia anomala, levadura aislada en la provincia de Misiones, en medios de cultivos con diferentes concentraciones de la fuente de carbono y energía (FCE) y de la fuente de nitrógeno. Los cultivos se realizaron en Erlenmeyers de 500 ml conteniendo 95 ml de un medio compuesto por 5 ó 10 g/l de glucosa; 0, 5, 10 ó 20 g/l de pectina de citrus y 6,7 ó 13,4 g/l de Yeast Nitrogen Base (YNB). Los mismos se incubaron a 30 °C, con agitación (150 rpm). Se tomaron muestras cada 12 h hasta los 3 días. La biomasa se separó por centrifugación y el sobrenadante se mantuvo a -18 °C hasta su utilización para la medida de la actividad PG (por determinación de grupos reductores liberados a partir de ácido poligalacturónico, mediante el método DNS) y glucosa residual (mediante kit enzimático). En los medios conteniendo 5 g/l de glucosa como única FCE, la producción de PG fue despreciable. Al adicionar 5 ó 10 g/l de pectina, la enzima se expresó alcanzando valores de 60 UE/ml y 99 UE/ml, respectivamente, a las 30 h de cultivo, pero no se incrementó con 20 g/l de pectina. El incremento en la concentración de glucosa o de YNB resultó en un aumento de la actividad enzimática. Se obtuvieron valores de actividad PG de 168 UE/ml y 145 UE/ml en medios con 10 g/l de glucosa y 13,4 g/l de YNB, respectivamente. La mayor producción de biomasa se obtuvo entre las 24 y 30 h de cultivo en todas las experiencias, tiempo a partir del cual el microorganismo entró en fase estacionaria. Al aumentar la concentración de pectina no se observó un aumento en la cantidad de biomasa, esto indicaría que el microorganismo no es capaz de utilizar pectina como FCE pero si la necesita como inductor. La máxima producción de PG se obtuvo durante las primeras 24-30 h de cultivo (crecimiento exponencial). El pH disminuyó en el transcurso de las fermentaciones en todos los medios estudiados (probablemente los ácidos orgánicos producidos no fueron metabolizados por el microorganismo). La glucosa fue rápidamente metabolizada ya que luego de 24-30 h se obtuvieron valores despreciables en todos los medios ensayados, coincidiendo con el máximo crecimiento microbiano. Pichia anomala es capaz de producir PG en medios de cultivo con glucosa, pectina e YNB. La producción de PG se realizó durante la fase de crecimiento exponencial, no es reprimida por glucosa y es inducida por pectina.

Microbial pectinases are very important in food industries mainly for their use in fruit and vegetable processing (winemaking, extraction and clarification of fruit juices, vegetable oil extraction, maceration of vegetables, etc.). Pectinases constitute a complex pool of enzymes that include: pectinesterases (PE), polygalacturonases (PG) and pectinlyases (PL). The objective of the present work was to study the kinetics of PG production by Pichia anomala, a wild yeast isolated in the province of Misiones, in culture media with different concentrations of carbon and energy source (CES) and nitrogen source. Cultures were grown in 500 ml-Erlenmeyer flasks with 95 ml of a medium containing 5 or 10 g/l glucose; 0, 5, 10 or 20 g/l citrus pectin and 6.7 or 13.4 g/l Yeast Nitrogen Base (YNB), at 30 °C, in a rotary shaker (150 rpm). Samples were taken every 12 h up to 3 days. Biomass was separated by centrifugation and the supernatant was kept at -18 °C until used for PG assay (by measuring the reducing groups released from polygalacturonic acid by DNS method) and residual glucose (by enzymatic kit). In culture media containing 5 g/l glucose as a sole CES, PG production was negligible. The enzyme was expressed by addition of 5 or 10 g/l of pectin, reaching values of 60 EU/ml and 99 EU/ml, respectively, at 30 h of cultivation, but enzyme activity did not increase with 20 g/l of pectin. The increase in the concentration of glucose or YNB resulted in an increase in enzyme activity. PG activity values of 168 EU/ml and 145 EU/ml were found in media with 10 g/l glucose and 13.4 g/l of YNB, respectively. The highest biomass production was obtained between 24 and 30 h of culture in all experiments, time at which the microorganism reached the stationary phase. Higher concentration of pectin did not result in an increase in biomass concentration; this would indicate that the microorganism is not capable of using pectin as CES but it is necessary as enzyme inducer. Maximum PG production was obtained during the first 24-30 h of culture (exponential growth). pH decreased during fermentation in all media studied (probably organic acids produced were not metabolized by the microorganism). Glucose was rapidly metabolized; negligible values were found in all media tested after 24-30 h of culture, coinciding with the maximum of microbial growth. Pichia anomala is capable of producing PG in culture media containing glucose, pectin and YNB. PG production takes place during the exponential growth phase; its production is not repressed by glucose and is induced by pectin.