Estudio funcional de genes involucrados en la simbiosis fijadora de nitrógeno

Abstract

Las leguminosas son capaces de establecer una simbiosis con bacterias que convierten el nitrógeno atmosférico a formas utilizables para la planta. Esta fijación de nitrógeno ocurre en órganos postembrionarios formados en la raíz llamados nódulos. El establecimiento de esta simbiosis involucra la participación de mecanismos de señalización que derivan en la activación de diferentes factores de transcripción. Los miembros de la familia del factor nuclear Y (NF-Y) se han implicado en diferentes etapas de la simbiosis del nódulo de la raíz. Anteriormente hemos demostrado que NF-YA1 y NF-YC1 juegan un papel crucial durante la nodulación, modulando la expresión de los genes del ciclo celular de transición G2/M en poroto (Phaseolus vulgaris). Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) seguido de PCR mostró un enriquecimiento de la región del promotor de una ciclina P en raíces que expresan FLAG-NF-YC1 en comparación con las raíces transformadas con el vector vacío, lo que sugiere que PvNF-YC1 se une directamente a esta región promotora y podría modular su expresión. El gen ortólogo de M. truncatula codifica para una ciclina tipo P4 que se expresa principalmente en la zona meristemática del nódulo y podría estar implicado en la reactivación del ciclo celular que inicia la organogénesis del nódulo. En el presente trabajo de tesis, para dilucidar la función biológica del gen PvCYCP4-1 en el contexto de la simbiosis fijadora de nitrógeno, se utilizó una estrategia de RNAi para reducir sus niveles de mRNA en raíces de poroto seguida de una caracterización del fenotípo. El silenciamiento de PvCYCP4-1 produjo a una marcada reducción en la cantidad y el tamaño de los nódulos formados por Rhizobium etli y afectó negativamente la frecuencia de los eventos de infección. Estos datos sugirieron que PvCYCP4-1 podría desempeñar un papel en la activación de las divisiones de células corticales necesarias para el desarrollo de nódulos y la infección de rizobios. Por otro lado, para investigar el papel de las moléculas de señalización bacterianas en la activación de los genes de respuesta a la simbiosis, hemos realizado un análisis del transcriptoma de raíces de P. vulgaris inoculadas con cepas mutantes de R. etli defectuosas en la síntesis de Nod Factor, exopolisacáridos o lipopolisacáridos. Se identificó un gen asociado a la regulación de la expresión génica mediada por pequeños RNAs, que codifica una proteína con dominio XH/XS. Este gen es ortólogo al gen IDN2 de Arabidopsis thaliana, una proteína de unión a RNA de doble cadena involucrada en la ruta de metilación del DNA dirigida por RNA (RdDM). Para obtener información sobre el papel de PvIDN2 durante la infección de la raíz y la organogénesis de los nódulos, se llevó cabo un análisis funcional de PvIDN2 utilizando RNAi. El análisis fenotípico mostró que las plantas con niveles reducidos de PvIDN2 exhibieron una reducción en el número de nódulos formados por R. etli en comparación con las raíces de control. Además, la frecuencia de los eventos de infección se vio afectada por el silenciamiento de PvIDN2. Estos resultados sugieren que PvIDN2 podría desempeñar un papel tanto en la infección de rizobios como en la organogénesis de los nódulos en las raíces de P. vulgaris. Utilizando la técnica de inmunoprecipitación de DNA metilado (MeDIP) pudimos demostrar que el silenciamiento génico postranscripcional de PvIDN2 afecta los niveles de metilación de genes que se encuentran asociados a los picos de acumulación de hetsiRNAs, permitiendo establecer una relación entre PvIDN2 y la ruta del RdDM. El conjunto de resultados obtenidos en este trabajo de tesis contribuyen a comprender en mayor detalle los mecanismos moleculares que gobiernan el establecimiento de una simbiosis fijadora de nitrógeno eficiente entre P. vulgaris y R. etli, además de que sienta las bases para futuros proyectos de investigación que permitan optimizar la fijación de nitrógeno en una planta de alto valor social e interés agronómico.