Avances en la interacción de alfa hemolisina de <i>E. coli</i> con glóbulos rojos humanos: potencial uso del dominio N-terminal en la construcción de inmunotoxinas

Abstract

Nuestro grupo de trabajo se especializa en el estudio del mecanismo de acción de alfa hemolisina, una toxina extracelular secretada por cepas uropatogénicas de Escherichia coli. En particular, esta tesis doctoral, se basa en el estudio de la interacción de HlyA con glóbulos rojos humanos. Glicoforina se postuló como proteína receptora de HlyA en glóbulos rojos, aunque existen resultados contradictorios al respecto. Al estudiar la actividad de HlyA, en eritrocitos carentes de glicoforina A y B, observamos que no presentaba diferencias respecto de la actividad en glóbulos rojos normales, por lo que nos propusimos estudiar la presencia de otra proteína receptora mediante la técnica de Far Western Blot. Por otro lado, previamente nuestro grupo demostró que HlyA interacciona directamente con colesterol, lo cual facilita la oligomerización de la toxina en membrana y la subsecuente lisis de los glóbulos rojos. En la secuencia de la toxina se encontraron secuencias CRAC (Cholesterol Recognition/interaction Aminoacid Consensus sequence) y CARC (de igual secuencia, pero en sentido contrario). A partir de estos resultados se sintetizaron péptidos con secuencias CRAC y CARC, presentes en el dominio de inserción en la membrana y en la región entre los ácidos grasos de HlyA. Los péptidos se sintetizaron mediante la técnica de síntesis química en fase sólida (SPPS) y se caracterizó su interacción con membranas con diferente porcentaje de colesterol por técnicas como Surface Plasmon Resonance (SPR), monocapas de Langmuir y simulaciones de dinámica molecular. Los resultados obtenidos a partir del estudio de la interacción de HlyA con la membrana, nos permitieron plantear el uso de distintos dominios de la toxina como herramientas terapéuticas. Específicamente, planteamos el uso de un péptido correspondiente a un sitio CRAC entre los ácidos grasos para inhibir la actividad lítica de la toxina; y un péptido correspondiente al dominio de inserción de la toxina para la construcción de una inmunotoxina. Para esto último se lo conjugó químicamente a anti-trop-2 (anticuerpo que reacciona contra una proteína de membrana sobreexpresada en células tumorales), mostrando actividad citotóxica en células tumorales de mama (MCF-7). En conclusión, los resultados obtenidos desde la investigación básica aportan conocimiento sobre la interacción de HlyA con glóbulos rojos humanos y su mecanismo de acción. Además, esta caracterización bioquímica-biofísica permitió el diseño de terapias alternativas para el tratamiento de infecciones bacterianas causadas por cepas uropatogénicas de Escherichia coli y proponer el diseño de una inmunotoxina para el tratamiento del cáncer de mama.