Participación del ácido 20-hidroxieicosatetraenóico (20-HETE) en el desarrollo tumoral en un modelo murino de cáncer de próstata

Abstract

El cáncer de próstata es una de las neoplasias malignas más frecuentes en la población masculina mundial, y la enfermedad metastásica la principal causa de muerte asociada a esta enfermedad1,2. El requerimiento de nuevas drogas en el escenario terapéutico ha llevado a la búsqueda de nuevos partícipes en el desarrollo de este tipo de tumor. La relevancia del ácido 20-hidroxieicosatetraenóico (20-HETE), producto del metabolismo del ácido araquidónico por las isoformas del citocromo P450 (CYP4F2 y CYP4A11), ya ha sido estudiada en varios tipos tumorales, y existen evidencias in vitro e in vivo que sostienen su participación en algunos aspectos relevantes de la biología tumoral3,4. Sin embargo, el conocimiento de su importancia en la biología del cáncer de próstata es muy escasa. Si bien datos previos, obtenidos in vitro demostraron la contribución del 20-HETE al sostenimiento de la viabilidad de células de cáncer de próstata sensibles a andrógenos (LNCaP)5, aun no existen datos in vivo que revelen su aporte al desarrollo tumoral. Planteamos entonces, como objetivo principal del presente trabajo evaluar in vivo la participación del 20-HETE en el desarrollo tumoral en un modelo murino de cáncer de próstata hormono dependiente. Los objetivos específicos fueron: Objetivo específico 1: Esclarecer si la inhibición sistémica de la síntesis del 20-HETE disminuirá el crecimiento de tumores generados por células LNCaP en animales intactos. Objetivo específico 2: Comparar el efecto de la inhibición sistémica de la síntesis del 20-HETE sobre el crecimiento de tumores generados por células LNCaP entre animales intactos y orquiectomizados. Para ello desarrollamos un modelo murino de cáncer de próstata en ratones inmunosuprimidos. De los estudios preliminares realizados concluimos que, en nuestras condiciones experimentales, el modelo más favorable sería la inyección en el flanco dorsal derecho de células sensibles a andrógenos, LNCaP, (5x106cel/0,1ml), resuspendidas en Matrigel. Cuando los tumores alcanzaron un volumen entre 100-150 mm3, los animales fueron separados aleatoriamente en los siguientes grupos experimentales: intactos (CONTROL), sometidos a castración quirúrgica (QX), tratados con un inhibidor de la síntesis del 20-HETE (HET0016), y castrados-tratados (QX+HET0016). Para la inhibición sistémica de la síntesis del 20-HETE se utilizó N-hydroxy-N'-(4-n-butyl-2-methylphenyl) Formamidine (HET0016, 10mg/kg/día, vía de administración intraperitoneal ( i.p) cinco días a la semana) 6. Los tumores se midieron tres veces por semana y los animales fueron sacrificados cuando el diámetro mayor tumoral llegó a los 17,0 mm. Las muestras tumorales obtenidas de la necropsia fueron separadas para el estudio histológico e inmunohistoquímico y para determinar la expresión de proteínas totales por Western blot. En el análisis del curso temporal del crecimiento de los tumores se observó que éste fue sostenido en los animales controles. Por el contrario, en los grupos HET0016 y QX, el crecimiento fue menor durante la primera semana, pero, entre los días siete y catorce aproximadamente, la pendiente de crecimiento se asemejó al control. En cambio, la tasa de crecimiento tumoral fue sostenidamente menor en el grupo QX+HET0016, hasta el día nueve y, con la excepción de un repunte transitorio entre los días nueve - dieciséis, la tasa de crecimiento permaneció baja hasta el sacrificio de los animales. El volumen tumoral final resultó menor al control en todos los grupos experimentales (control 1271±43 mm3, QX 1041±22 mm3, HET0016 1084±42 mm3, QX+HET0016 857±47 mm3, vs. Control * p<0,05, **p<0,01, **** P<0.0001 para los grupos HET0016, QX y QX+HET0016 respectivamente). El examen histológico de los preparados reveló una arquitectura tumoral conservada, con células poliédricas con núcleos redondeados y eucromáticos, y nucleolos evidentes. No hubo diferencias entre grupos a excepción del grupo QX+HET0016, donde se observan células con cromatina nuclear condensada, con apariencia de picnosis, y citoplasma vacuolado. La expresión inmunohistoquímica de CYP4F2 resultó positiva en todos los preparados. Del análisis de las muestras tumorales surge que la proliferación celular, estimada por el índice mitótico, fue menor al control en todos los grupos restantes (en %: control 13.20±1,15, QX 3.51±0,42, HET0016 10.37±0,70, QX+HET0016 3.34±0,66, vs. Control: HET0016 p≤0.05; QX y QX+HET0016 p≤0.0001). En cuanto a la vascularización, evaluada por la expresión del marcador vascular CD31, el análisis cuantitativo mostró una disminución significativa de 69% respecto del control sólo en el grupo QX+HET0016 (p<0,01). En este último grupo la vascularización también resultó menor a los grupos QX y HET0016 (p<0,05 para ambos). Finalmente, se analizó por Western blot la expresión del CYP4F2 y del receptor de andrógenos en homogenatos tumorales. La expresión del CYP4F2 fue significativamente menor al control en los grupos QX y QX+HET0016 (p<0,01 para ambos). El tratamiento con HET0016 redujo la expresión del CYP4F2 respecto del grupo QX (p<0,01). En cuanto al receptor de andrógenos, en el grupo QX su expresión aumentó en un 90% respecto del control (p≤0.0001), sin cambios en el grupo HET0016. El efecto más relevante del tratamiento con HET0016 fue la dramática reducción de la expresión del receptor de andrógenos en el grupo QX+HET0016 respecto del grupo QX (77%, p≤0.0001), aún por debajo de la expresión en el grupo control (p≤0.01). La reducción del volumen tumoral y del índice mitótico en los animales tratados con HET0016 sugiere que el 20-HETE desempeña un papel importante en el desarrollo del tumor. Por otro lado, el hecho de que el HET0016 no afectara la vascularización del tumor no desestima los efectos proangiogénicos del 20-HETE observados in vitro5, e indica que el 20-HETE no es el único responsable de este proceso. Así, su disminución puede haber sido compensada por otros factores proangiogénicos. Más aún, a partir de la importante disminución de la vascularización en los animales QX+HET0016, que también se observó en la tasa de crecimiento y en el volumen tumoral final, podríamos inferir que existe una cooperación entre el 20-HETE y los andrógenos en el desarrollo tumoral. Es importante destacar que la combinación de ambos tratamientos redujo significa mente la expresión del CYP4F2 (y por ende la disponibilidad del 20-HETE), y revirtió la sobreexpresión del receptor de andrógenos secundaria a la castración. Debido a que la expresión de una amplia variedad de genes asociados a la tumorigénesis está bajo regulación del receptor de andrógenos, esta última observación es clave para la interpretación del menor desarrollo tumoral en los animales QX+HET0016. De esta forma, el presente trabajo aporta evidencias que señalan al 20-HETE como un partícipe en el desarrollo del cáncer de próstata. Los resultados aquí presentados abren la posibilidad de interferir en un futuro con su síntesis como una posible herramienta terapéutica, en particular asociado a terapias de depleción androgénica.