Estudio sobre factores de patogenicidad de Leptospira interrogans en líneas celulares

Abstract

El presente trabajo de tesis se ha realizado con el objetivo de establecer el perfil proteico de dos cepas patógenas de Leptospira mediante electroforesis, inmunoblot y estudio de la acción citotóxica del factor más importante de patogenicidad en línea celular. Se utilizaron cepas de leptospiras pertenecientes a la serovar icterohaemorrhagiae: una de referencia internacional (Cepa 1) y otra de aislamiento propio (Cepa 2). Como testigo se utilizó una cepa de L. biflexa sv. patoc cepa Salomon (Cepa 3), conocida como apatógena y proveniente de aislamientos propios. Se realizaron corridas en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio y se realizó la técnica de Inmunoblot. Se purificó la fracción LipL32 por filtración por gel. La valoración de la actividad citotóxica de la fracción obtenida se realizó por medio de la inoculación en línea VERO. Los patrones de bandas electroforéticas de las cepas empleadas mostraron similitudes entre las cepas patógenas y escasa diferencia con la cepa apatógena. La técnica del Inmunoblot permite identificar las muestras libres de contaminantes periplasmáticos como los flagelos y proteínas ligadas a penicilinas. En este estudio pudo demostrarse que tanto la cepa autócotona como la de referencia mostraron bandas por PAGE semejantes, siendo la aislada en nuestro país levemente mayor en su efecto citopatogénico, aunque no de significación estadística. Por inmunoblot, pudo visualizarse, además, que ellas mostraron mucha reactividad para la LipL32 cuando fueron enfrentados con sueros de nutrias naturalmente enfermas de Leptospirosis. En este estudio, hemos confirmado la citotoxicidad de la LipL32 sobre las líneas celulares. Sin embargo tanto en la cepa autóctona como en la de referencia internacional, este efecto sólo se observa a bajas diluciones, perdiéndose esta propiedad ante diluciones mayores a 1:20. En conjunto, estos estudios permitirían inferir que el uso de esta fracción podría ser de utilidad para el diagnóstico temprano o específico de la leptospirosis particularmente en nutrias tanto de criadero como salvajes, pudiéndose realizar pruebas como ELISA con la fracción purificada para un mejor y rápido diagnóstico.

This thesis has been made in order to establish the protein profile of two Leptospira pathogen strains by immunoelectrophoresis, immunoblot and by citotoxicity of the major factor on cell culture. Polyacrilamide gels runs with dodecil sodium sulphate were done and the immunoblot technique was employed. LipL32 fraction was purified by gel meanwhile the citotoxicity was assessed by inoculation onto Vero cells. Electroforesis patterns in this survey showed similarities among the pathogenic strains, and little difference with the non-pathogenic one. Immunoblot technique allows to identify the samples free of periplasmatic contaminants as flagellae and penicillin-bound-proteins. This study demonstrated that the autochtonous and the reference strains showed similar PAGE bands, being the first a little more citopathogenic, although not statistically significant. Both strains reacted strongly with LipL32 when confronted against naturally diseased- nutria sera. It was confirmed here, too, the citotoxicity of the LipL32 on the cell culture. Nevertheless, the effect of both strains could have observed on lower dilutions, losing this property on higher dilutions of >1:20. Overall, these studies could visualize the usefulness of this fraction as an early and specific diagnostic tool of leptospirosis (i.e.as an ELISA), particularly on farm-breed and free-range nutria, after being purified.