Estudio de megaplásmidos en Sphingomonas degradadoras de hidrocarburos policíclicos aromáticos

Abstract

La biorremediación es una metodología que proporciona una solución económica, eficaz y permanente para el tratamiento de suelos contaminados con hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). La inoculación con microorganismos degradadores en ambientes contaminados (bioaumento) es una de las estrategias utilizadas en los últimos años. El género Sphingomonas (sensu latu) ha sido intensamente estudiado debido a su gran diversidad catabólica, siendo capaz de degradar un amplio rango de compuestos xenobióticos, diferentes herbicidas y pesticidas. En los últimos años se ha demostrado que muchas Sphingomonas poseen plásmidos (a menudo varios) y especialmente plásmidos de gran tamaño, comúnmente denominados megaplásmidos. Además, cada vez hay más pruebas de la existencia de plásmidos que sólo pueden diseminarse entre las Sphingomonas y que sufren, tras la transferencia conjugativa, reordenamientos pronunciados. El objetivo de este trabajo era demostrar la presencia de megaplásmidos en nuestra colección de cepas de Sphingomonas degradadoras de HAP (1A, 22A, 22B, S. paucimobilis 20006FA, AM) aisladas de suelos de diferentes regiones con distintos historiales de contaminación; para caracterizarlas y encontrar pruebas de la presencia de genes degradadores de HAP localizados en megaplásmidos. La presencia de megaplásmidos en las cepas degradadoras de HAP se demostró mediante la técnica de lisis in situ. Se observaron las mismas bandas de movilidad por electroforesis en todas las preparaciones de megaplásmidos, lo que demuestra que las cepas degradadoras de HAP tendrían al menos un megaplásmido. Para mostrar las diferencias de secuencia y peso molecular, se obtuvo el patrón de restricciones de los megaplásmidos a partir de plásmidos purificados mediante el protocolo de Kieser. Se visualizaron los mismos perfiles de restricciones para las cepas analizadas con las enzimas EcoRI, XbaI, HindIII, y se calculó el peso molecular en 40-50 kpb. Estos resultados sugieren que, a pesar de haber sido aisladas de suelos diferentes, las cepas de Sphingomonas degradadoras de PAH estudiadas podrían tener megaplásmidos relacionados más estrechamente. La localización de los genes degradadores de HAP en los megaplásmidos se puso de manifiesto mediante PCR con cebadores específicos de género dirigidos al gen de la enzima catecol 2,3-dioxigenasa de las proteobacterias. La banda de peso molecular esperada fue secuenciada mostrando un 100% de identidad y un 97% de cobertura con la enzima catecol 2,3-dioxigenasa de Sphingomonas PNB y Sphingobium BNQ31 ambos degradadores de PAH, confirmando la probable localización del gen. Se realizaron diferentes ensayos de conjugación entre Sphingomonas degradadoras de HAP, E. coli S17 1 y E. coli DH5α para aumentar la evidencia de la localización de la degradadora de HAP. No se obtuvieron pruebas de transferencia de plásmidos por conjugación entre Sphingomonas y otras proteobacterias. El fracaso de la conjugación entre las proteobacterias α y γ indicaría que los megaplásmidos serían incapaces de conjugarse o replicarse en diferentes grupos de proteobacterias. Este resultado, junto con la gran similitud encontrada entre los megaplásmidos de Sphingomonas degradadoras de PAH fenotípicamente diversas, sugiere que la propiedad degradadora podría transferirse específicamente entre este gen bacteriano.