Estudios embriológicos y de desarrollo de flores e inflorescencias en Barnadesioideae (Asteraceae)

Abstract

La familia Asteraceae es una de las más diversas de las Angiospermas y varios análisis filogenéticos la han ubicado como el grupo hermano de la familia Calyceraceae, en un clado bien soportado, conocido como el clado MGCA (Menyanthaceae, (Goodeniaceae, (Calyceraceae, Asteraceae))) (Lundberg & Bremer, 2003). Hipótesis recientes sugieren la presencia de un ancestro paleotetraploide para el clado Calyceraceae + Asteraceae y uno paleohexaploide para la familia Asteraceae (Barker et al., 2016). Las Barnadesioideae, con sólo 10 géneros y 95 especies, endémicas de América del Sur (Mandel et al., 2019), son el clado hermano de las restantes asteráceas (con entre 25000 y 35000 especies). A pesar de la enorme diversidad morfológica de las Asteraceae, dos estructuras consideradas innovaciones evolutivas las definen: la inflorescencia (capítulo) y el fruto (cipsela anemócora). Sobre la base de estudios del control genético del desarrollo en Gerbera (Asteraceae) y de desarrollo de las inflorescencias de las Calyceraceae, hoy se sabe que la inflorescencia o capítulo, interpretada históricamente como el resultado de la condensación de un racimo, ha tenido su origen en la modificación de una inflorescencia más compleja llamada tirsoide. En este sentido, el conocimiento del desarrollo de los capítulos de las barnadesioideas es particularmente relevante para interpretar la transición evolutiva entre las inflorescencias tirsoides y los capítulos típicos de las Asteraceae. Además de su diversidad morfológica, las asteráceas poseen una gran diversidad de caracteres en sus procesos embriológicos, conocida por las cerca de 350 publicaciones en los últimos 100 años siendo escasos los estudios embriológicos en la subfamilia Barnadesioideae. En los últimos años, la reconstrucción de filogenias sobre la base de caracteres moleculares ha permitido combinar la morfología y la embriología para interpretar su evolución en los géneros, tribus, familias, órdenes, e inclusive clados de rango mayor. Por ello, para poder comprender la evolución de la diversidad de caracteres reproductivos en general, y de los procesos embriológicos en particular en la familia Asteraceae es fundamental estudiarlos en las barnadesioideas. El objetivo de esta tesis es brindar una caracterización detallada y representativa del desarrollo de las inflorescencias, las flores, y de los procesos embriológicos de la subfamilia Barnadesioideae, enfocada en los siguientes cuatro aspectos: (1) el desarrollo temprano de las inflorescencias y flores, (2) las causas embriológicas del dimorfismo floral funcional (flores estaminadas/carpeladas vs. perfectas) presente en algunas especies de Barnadesioideae, (3) el desarrollo embriológico de las estructuras reproductivas masculinas (microesporangiogénesis, microsporogénesis y microgametogénesis) y (4) el desarrollo de los ovarios, óvulos, la estructura del fruto y la semilla, y el tipo de sustancia de reserva. Se estudió por primera vez el desarrollo temprano de los capítulos en una muestra amplia de especies de las Barnadesioideae con capítulos radiados en Barnadesia aculeata, B. odorata y Huarpea andina, con capítulos discoideos en Chuquiraga avellanedae, C. erinacea, C. jussieui, C. ruscifolia, C. ulicina, y Schlechtendalia luzulifolia, y con capítulos disciformes en Doniophyton weddellii y Duseniella patagonica, con observaciones de microscopía electrónica de barrido de inflorescencias diseccionadas en sus etapas más tempranas del desarrollo, complementadas con observaciones de microscopía de campo claro de cortes histológicos. Los resultados obtenidos mostraron variabilidad en cuanto a la forma del meristema, encontrándose planos y convexos y registrándose por primera vez el fenómeno de zonación meristemática en Barnadesia odorata. La mayoría de las especies analizadas exhiben pérdida del patrón filotáctico con zonas de receptáculo libre en el ápice hacia el fin de la iniciación y una disposición caótica de los primordios en el centro de la inflorescencia; y la presencia de flor terminal en dos especies de Chuquiraga y orientación variable de las flores en el capítulo. También se encontró una variedad de patrones para el fraccionamiento del meristema y para la organogénesis. La identidad de las flores del radio se estableció tempranamente por su tamaño menor como producto de un fraccionamiento diferencial del meristema, de su forma diferenciada y por el retraso en su desarrollo durante la organogénesis. El orden de iniciación de los verticilos en las flores es corola, androceo y gineceo (CAG), congruente con lo conocido para Asteraceae, y corroborando que la condición gamopétala de la corola se inicia tempranamente, con los lóbulos corolinos desarrollándose a partir de un anillo meristemático expresado en el estado de embudo. Finalmente, el papus es variable respecto a su aparición, iniciándose secuencialmente en cinco puntos alternipétalos. Los estudios de desarrollo floral de Doniophyton weddellii y Duseniella patagonica mostraron que la unisexualidad de las flores marginales femeninas se logra mediante el aborto tardío de los estambres o la supresión total o parcial del verticilo, pudiéndose adjudicar estos procesos a la muerte celular programada adelantada del tapete y al silenciamiento de genes controladores de la identidad de los verticilos florales, respectivamente. Se estudiaron etapas del desarrollo de anteras, de la microesporogénesis y microgametogénesis de Barnadesia odorata, Chuquiraga aurea, C. avellanedae, C. ruscifolia, C. erinacea, C. jussieui, C.parviflora, Dasyphyllum brasiliense, Doniophyton anomalum, D. weddellii, Duseniella patagonica, Huarpea andina y Schlechtendalia luzulifolia mediante cortes histológicos y tests histoquímicos que revelaron la expresión de diferenciación celular premeiótica (DCP) en arquésporas y la extensión del gradiente de DCP a células del tapete y corroboran un desarrollo de la pared del microesporangio de tipo dicotiledóneo, y la multiplicación de arquésporas para la subfamilia. Se observó también la presencia de ambos tipos de tapete, periplasmodial y secretor, se corroboró su origen doble, y se describió un síndrome de polarización del tapete secretor. Se describió la secuencia ontogenética de aparición de las capas de la esporodermis, su composición con una primexina y endexina polisacarídicas y proteicas, y se corroboró su estructura con ectexina mono, bi o tricapas y presencia o ausencia de cáveas. Se estudiaron por primera vez para esta subfamilia las sustancias de reserva de los granos de polen revelándose que existen especies starchy como starchless, condición probablemente relacionada al vector de polinización. Se describe por primera vez para Barnadesioideae un sistema complejo de interacción de tejidos durante la dehiscencia de las anteras en que participan además del endotecio, el tejido conectivo, la epidermis y la hipodermis conectiva, y se describe la participación diferencial de los tejidos en este mecanismo donde el endotecio de los lóculos externos presenta engrosamientos y una mecánica diferente a la de los lóculos internos. Mediante las mismas técnicas de inclusiones y cortes histológicos y test histoquímicos se estudiaron etapas del desarrollo de los ovarios y óvulos de Barnadesia arborea, B. odorata, Chuquiraga ruscifolia, Doniophyton weddellii, Duseniella patagonica y Huarpea andina; la anatomía de la semilla, pericarpo y embrión de Barnadesia polyacantha; y las sustancias de reserva de los embriones de C. erinacea, D. weddellii y Duseniella patagonica. Los óvulos son anátropos, unitegumentados, tenuinucelados incompletos, y poseen endotelio, en congruencia con lo conocido para el clado de las euastéridas (Core eudicots: Asterid alliance) y para Calyceraceae. Se corroboró el desarrollo de un único tegumento asimétrico o semi anular masivo de 12 a 25 células de espesor. La pared del fruto muestra un pericarpo con sólo exocarpo remanente, observándose por debajo hasta 8 capas de células correspondientes al tegumento del óvulo consumido. Se encontraron cristales, canales lisígenos o granos de almidón en estas capas. Se observó un embrión recto, espatulado y exendospermado, con una única capa de endosperma, y reservas en los cotiledones, con proteínas como sustancia de reserva principal y lípidos como sustancia de reserva secundaria. Como conclusión general, las Barnadesioideae no poseen el desarrollo y la estructura típica del capítulo de las restantes Asteraceae, pues aún conservan algunas características que los relacionan con los cefalodios de su grupo hermano, las Calyceraceae, como la presencia de una flor terminal, la orientación variable de las flores respecto del eje del capítulo, e indicios que sugieren una zonación del meristema de la inflorescencia en una área periférica y otra central. Los resultados obtenidos, contribuyen a la idea original de Erbar & Leins (2000) y los trabajos siguientes de Pozner et al. (2012), Claβen Bockhoff & Bull-Hereñu (2013), Zhao et al. (2016) y Elomaa et al. (2018) que progresivamente desarrollaron la hipótesis del origen evolutivo del capítulo de las Asteraceae a partir de una inflorescencia tirsoidea condensada (cefalodio), cuyo meristema se comporta como un meristema floral, tanto en estructura como en fraccionamiento, donde los primordios de los grupos cimosos se reutilizan para formar flores y la flor central se suprime. En cuanto al desarrollo floral, la secuencia de iniciación de ciclos florales que comienza con la corola y ubica al cáliz en diferentes momentos posteriores, ya está presente en algunas Calyceraceae y en Barnadesioideae. La iniciación variable del papus y su aparición en cinco puntos alternipétalos sería evidencia, de acuerdo a nuevos resultados del campo de la genética, de su origen sepaloide y su homología con el cáliz y puede considerarse una alteración del desarrollo relacionada a la profunda modificación del cáliz en las Asteraceae (cfr. Naghiloo & Claßen-Bockhoff, 2017). En cuanto a la sexualidad de las flores, las flores pistiladas de Barnadesioideae pueden haber surgido por dos mecanismos diferentes: uno que detiene el normal desarrollo de la microsporogénesis y otro que inhibe el desarrollo de los primordios estaminales. En las Calyceraceae, en cambio, no hay especies con flores pistiladas, sólo Acicarpha combina flores perfectas con estaminadas por interrupción del proceso de megasporogénesis. Es así como el grupo hermano de las Asteraceae tiene especies con todas sus flores perfectas, y especies andromonoicas. La ginomonoecia y la presencia de flores estériles, propia de las Asteraceae, ya está presente en las Barnadesioideae. En cuanto a los caracteres embriológicos es posible reconocer que las Barnadesioideae poseen un desarrollo normal de las anteras y del polen, que se asemeja al de la mayoría de las dicotiledóneas. La megasporogénesis y megagametogénesis observada en Barnadesioideae, que conduciría a un tipo de desarrollo Polygonum, es la más frecuente en angiospermas. En cuanto a la anatomía de óvulos y semillas, los resultados concuerdan con lo ya conocido para Barnadesioideae y con lo esperable para la familia Asteraceae y el clado de las euastéridas. La información sugiere que las Barnadesioideae poseen procesos embriológicos regulares y comunes a la mayoría de las angiospermas, y que éstos procesos podrían haber estado presentes en el ancestro común más reciente de las Asteraceae, siendo el punto de partida para la inmensa inmensa diversificación embriológica que se conoce en las restantes Asteraceae.

The Asteraceae is one of the most diverse families of the angiosperms and several phylogenetic analyses have placed it as the sister group of the Calyceraceae family, in a well-supported clade, known as the MGCA clade (Menyanthaceae, (Goodeniaceae, (Calyceraceae, Asteraceae) )) (Lundberg & Bremer, 2003). Recent hypotheses suggest the presence of a paleotetraploid ancestor for the Calyceraceae + Asteraceae clade and a paleohexaploid ancestor for the Asteraceae family (Barker et al., 2016). The Barnadesioideae, with only 10 genera and 95 species, is endemic to South America (Mandel et al., 2019), being the sister clade of the remaining Asteraceae (with between 25,000 and 35,000 species). Despite the enormous morphological diversity of the Asteraceae, two structures considered evolutionary innovations define this family: the inflorescence (capitulum) and the fruit (wind-dispersed cypsela). Based on studies of the genetic control of development in Gerbera (Asteraceae) and development in the inflorescences of Calyceraceae, it is now known that the inflorescence or capitula, historically interpreted as the result of the condensation of a cluster, has had its origin in the modification of a more complex inflorescence called thyrsoid. In this sense, to know the development of the capitula of the barnadesioid is particularly relevant to understand the evolutionary transition between the thyrsoid inflorescences and the typical capitula of the Asteraceae. In addition to their morphological diversity, Asteraceae have a huge diversity of characters in their embryological processes, known from the nearly 350 publications in the last 100 years, with few embryological studies in the subfamily Barnadesioideae. In recent years, the reconstruction of phylogenies based on molecular characters has allowed combine morphology and embryology to interpret their evolution within genera, tribes, families, orders, and even higher-ranking clades. Therefore, to understand the evolution of the diversity of reproductive characters in general, and of embryological processes in particular in the Asteraceae family, it is essential to study them in barnadesioid. The objective of this thesis is to provide a detailed and representative characterization of the development of inflorescences, flowers, and embryological processes of the subfamily Barnadesioideae focused on the following four aspects: (1) the early development of inflorescences and flowers, (2) the embryological causes of functional floral dimorphism (staminate/carpelate vs. perfect flowers) present in some species of Barnadesioideae, (3) the embryological development of male reproductive structures (microsporangiogenesis, microsporogenesis and microgametogenesis) and (4) the development of ovaries, ovules, the structure of the fruit and seed, and the type of storage substance. The early development of capitula was studied for the first time in a large sample of species of the Barnadesioideae: with ray capitula in Barnadesia aculeata, B. odorata and Huarpea andina, with discoid capitula in Chuquiraga avellanedae, C. erinacea, C. jussieui, C. ruscifolia, C. ulicina, and Schlechtendalia luzulifolia, and with disciform capitula in Doniophyton weddellii and Duseniella patagonica, using scanning electron microscopy observations of inflorescences dissected in their earliest stages of development, complemented by light microscopy observations of histological sections. The results obtained showed variability in the shape of the meristem, being flat and convex, and the phenomenon of meristematic zonation was recorded for the first time in Barnadesia odorata. Most of the species analyzed exhibit loss of the phyllotactic pattern with areas of free receptacle at the apex towards the end of initiation and a chaotic arrangement of the primordia in the center of the inflorescence; the presence of a terminal flower in two species of Chuquiraga and variable orientation of the flowers in the capitula. A variety of patterns for meristem fractionation and organogenesis were also found. The identity of the ray flowers was established early due to their smaller size as a product of differential fractionation of the meristem, their differentiated shape and the delay during their organogenesis. The order of initiation of the whorls in the flowers is corolla, androecium and gynoecium (CAG), being consistent with what is known for Asteraceae, and corroborating that the gamopetalous condition of the corolla begins early, with the corolla lobes developing from a meristematic ring expressed in the funnel state. Finally, the pappus inception is variable, starting sequentially at five alternipetal points. Studies of floral development of Doniophyton weddellii and Duseniella patagonica showed that the female condition of marginal flowers is achieved by late abortion of the stamens or the total or partial suppression of the whorl, these processes being able to be attributed to the early programmed cell death of the tapetum and to the silencing of genes controlling the identity of floral whorls, respectively. Stages of anther development, microsporogenesis and microgametogenesis were studied in Barnadesia odorata, Chuquiraga aurea, C. avellanedae, C. ruscifolia, C. erinacea, C. jussieui, C. parviflora, Dasyphyllum brasiliense, Doniophyton anomalum, D. weddellii, Duseniella patagonica, Huarpea andina and Schlechtendalia luzulifolia through histological sections and histochemical tests revealed: the expression of premeiotic cellular differentiation (PCD) in archespores and the extension of the PCD gradient to tapetal cells; a dicotyledonous type of microsporangium wall development; and the multiplication of archespores for the subfamily. The presence of both types of tapetum, periplasmodial and secretory, was also observed, its double origin was corroborated, and a polarization syndrome of the secretory tapetum was described. The ontogenetic sequence of appearance of the layers of the sporodermis was described, its composition with a polysaccharide and protein primexin and endexin, and its structure was corroborated with mono, 2- or 3-layered ectexin and presence or absence of caveas. The storage substances of pollen grains were studied for the first time for this subfamily, revealing that there are starchy and starchless species, a condition probably related to the pollination vector. A complex system of tissue interaction during anther dehiscence is described for the first time for Barnadesioideae, in which, in addition to the endothecium, the connective tissue, the epidermis and the connective hypodermis participate, and the differential participation of the tissues in this mechanism is described. where the endothecium of the external locules presents thickening and a different mechanics than that of the internal locules. Using the same techniques of histological sections and histochemical tests, stages of development of the ovaries and ovules of Barnadesia arborea, B. odorata, Chuquiraga ruscifolia, Doniophyton weddellii, Duseniella patagonica and Huarpea andina were studied; the anatomy of the seed, pericarp and embryo of Barnadesia polyacantha; and the storage substances of the embryos of C. erinacea, D. weddellii and Duseniella patagonica. Ovules are anatropous, unitegumented, incompletely tenuinucellated, and have endothelium, in congruence with what is known for the euasterid clade (Core eudicots: Asterid alliance) and for Calyceraceae. The development of a single massive asymmetric or semi-annular integument 12 to 25 cells thick was confirmed. The fruit wall has only the exocarp remaining, followed by with up to 8 layers of cells corresponding to the integument of the consumed ovule observed below. Crystals, lysigenous channels or starch grains were found in these layers. A straight, spatulated embryo was observed, with a single layer of endosperm, and storage substances in the cotyledons: proteins as the main storage substance and lipids as the secondary ones. As a general conclusion, the Barnadesioideae do not have the typical capitulum development and structure of the remaining Asteraceae, as they still retain some characteristics that relate them to the thyrsoid cephalodia of their sister group, the Calyceraceae, such as the presence of a terminal flower, the orientation variable of the flowers towards the axis of the capitula, and observations that suggest a zonation of the inflorescence meristem in a peripheral and a central area. The results obtained contribute to the original idea of Erbar & Leins (2000) and the following works of Pozner et al. (2012), Claβen Bockhoff & Bull-Hereñu (2013), Zhao et al. (2016) and Elomaa et al. (2018) who progressively developed the hypothesis of the evolutionary origin of the Asteraceae capitula from a condensed thyrsoid inflorescence (cephalodium), whose meristem behaves like a floral meristem, both in structure and fractionation, where primordia of the cymose groupsare reused to form flowers and the central flower is suppressed. Regarding floral development, the sequence of initiation of floral cycles that begins with the corolla and places the calyx at different later times is already present in some Calyceraceae and Barnadesioideae. The variable initiation of the pappus and its inception in five alternipetal points would be evidence, according to new results from the field of genetics, of its sepaloid origin and its homology with the calyx and can be considered a developmental alteration related to the profound modification of the calyx in the Asteraceae (cf. Naghiloo & Claßen-Bockhoff, 2017). Regarding flower sexuality, the pistillate flowers of Barnadesioideae may have arisen by two different mechanisms: one that stops the normal development of microsporogenesis and another that inhibits the development of staminal primordia. In the Calyceraceae, on the other hand, there are no species with pistillate flowers, only Acicarpha combines perfect flowers with staminate ones by interrupting the megasporogenesis process. This is how the sister group of the Asteraceae has species with all their flowers perfect, and andromonoecious species. Gynomonoecy and the presence of sterile flowers, typical of the Asteraceae, is already present in the Barnadesioideae. Regarding embryological characters, it is possible to recognize that the Barnadesioideae have a normal development of anthers and pollen, which is similar to most dicotyledons. The megasporogenesis and megagametogenesis observed in Barnadesioideae, which would lead to a Polygonum type of development, is the most frequent in angiosperms. Results on the anatomy of ovules and seeds agree with what is already known for Barnadesioideae, Asteraceae family and the euasterid clade. The information suggests that the Barnadesioideae have regular embryological processes common to most angiosperms, and that these processes could have been present in the most recent common ancestor of the Asteraceae, being the starting point for the immense embryological diversification known in the remaining Asteraceae.