Plaguicidas nanofuncionalizados de 2,4-D y lambdacialotrina: estudio de efectos cito- y genotóxicos y sus posibles mecanismos de acción en sistemas in vitro e in vivo

Abstract

A nivel mundial, en la última década el uso promedio de plaguicidas aumentó un 50% con respecto a 1990 en consonancia con el aumento en la producción agrícola. Argentina, en particular ocupa el cuarto lugar a nivel mundial entre los países que más plaguicidas aplican para el control de plagas en la producción agrícola. La nanotecnología en la industria agroquímica comenzó a aplicarse principalmente con el objetivo de introducir mejoras en las formulaciones de plaguicidas y fertilizantes. Dado el desarrollo relativamente reciente de las micro y nanoformulaciones, el conocimiento disponible sobre su destino, comportamiento en el ambiente y sus posibles efectos perjudiciales sobre la biota y la salud humana aún son escasos. El presente trabajo de Tesis Doctoral tuvo como objetivo general evaluar la capacidad deletérea del herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D) y de su microformulación comercial Dedalo Elite (30% 2,4-D), al igual que el insecticida lambdacialotrina (LCT) y su microformulación comercial Karate® (25% LCT), plaguicidas ampliamente empleados en diversos cultivos de nuestro país. Los efectos inducidos por el herbicida 2,4-D y su microformulación comercial Dedalo Elite, y del insecticida LCT y su microformulación comercial Karate® fueron evaluados empleando como modelo de estudio in vitro la línea celular de mamífero CHO-K1 y como modelo in vivo larvas premetamórficas de Rhinella arenarum (Amphibia, Anura) en estadio Gosner 37 ± 2. Para evaluar los efectos genotóxicos inducidos por 2,4-D, LCT y sus formulaciones comerciales se emplearon in vitro, el Ensayo Cometa (EC) en su variante alcalina, el EC modificado con enzimas de restricción y el ensayo del citoma e in vivo el EC en su versión alcalina. Los efectos citotóxicos inducidos por 2,4-D, LCT y sus formulaciones comerciales Dedalo Elite y Karate® fueron evaluados mediante los ensayos colorimétricos de captación de Rojo Neutro (RN) y MTT, el índice de división nuclear (IDN) y el estudio de muerte celular programada o apoptosis. Finalmente, se evaluó en R. arenarum la capacidad de Dedalo Elite y Karate® de inducir estrés oxidativo mediante los biomarcadores enzimáticos y no enzimáticos catalasa (CAT), glutatión-S-transferasa (GST) y glutatión (GSH). En células CHO-K1 mediante la variante alcalina del EC se observó que 2,4-D en las concentraciones de 6 y 10 µg/ml y su microformulado Dedalo Elite en las concentraciones de 2 y 4 µg/ml fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN. Se evaluó la genotoxicidad inducida in vivo por el microformulado Dedalo Elite en concentraciones ambientales mediante el EC en eritrocitos circulantes de larvas de R. arenarum. Los resultados demostraron que el microformulado fue capaz de ejercer daño en el ADN tras una exposición de 48 y 96 h. En el ensayo del citoma, cuando se llevó a cabo el análisis de las frecuencia de micronúcleos (MNs) y de anomalías nucleares inducidas en los cultivos tratados con 2,4-D mostró un aumento significativo en la frecuencia de MNs luego de la exposición a la mayor concentración empleada (10 µg/ml), un incremento en la frecuencia de buds nucleares (BNs) luego del tratamiento con las concentraciones de 1-4 µg/ml y un aumento en la frecuencia de los puentes nucleares (PNs) en los tratamientos de 0,1 y 2 µg/ml. Ninguno de los tratamientos de 2,4-D produjo un cambio significativo en los valores del índice de división nuclear (IDN). Luego de los tratamientos con el microformulado Dedalo Elite, se observó un aumento significativo en la frecuencia de MNs luego del tratamiento de 2 µg /ml. Además, para la concentración de 0,1 µg/ml la frecuencia de BNs aumentó de manera significativa, mientras que disminuyó de manera significativa para las concentraciones de 1 y 2 µg/ml. Asimismo, la frecuencia de PNs no se vió modificada de manera significativa. Cuando se llevó a cabo el ensayo de RN en células CHO-K1 tratadas con 2,4-D se observó que ninguna de las concentraciones ensayadas produjo alteraciones en la actividad lisosomal. Cuando las células fueron tratadas con Dedalo Elite se observó una disminución significativa de la actividad lisosomal en el rango de concentraciones de 4-100 µg/ml. Los valores obtenidos de los experimentos con MTT de células CHO-K1 expuestas a 2,4-D y Dedalo Elite demostraron que la actividad mitocondrial de las células tratadas con 10 y 100 μg/ml del principio activo (p.a.) se vió disminuida de manera significativa y las células tratadas con Dedalo Elite mostraron una inhibición de la actividad mitocondrial en el rango de exposición de 4-100 µg/ml. En el ensayo de muerte celular programada los datos obtenidos a partir del análisis por citometría de flujo de células CHO-K1 expuestas a 2,4-D y Dedalo Elite revelaron que luego del tratamiento con 4 y 10 µg/ml tanto del p.a. como del formulado se produjo un aumento significativo de las proporciones de células apoptóticas tempranas y tardías, siendo mayor el incremento observado cuando se empleó el microformulado. El EC modificado con enzimas de restricción reveló que las células CHO-K1 expuestas a 2,4-D y que recibieron un post-tratamiento con la endonucleasa de restricción Fpg no mostraron un aumento significativo del daño oxidativo neto (DO), mientras que en las células expuestas al microformulado si se observó un aumento significativo de este daño. Por otra parte, luego del tratamiento con la endonucleasa de restriccion Endo III tras la exposición de células CHO-K1 a 2,4-D no se observó un incremento el DO. Por el contrario, cuando las células se trataron con Dedalo Elite y posteriormente con la enzima previamente mencionada sí se observó un incremento en el DO. En cuanto a los resultados de los biomarcadores enzimáticos y no enzimáticos de estrés oxidativo estimados en larvas de R. arenarum expuestas a una concentración ambiental de 0,001 mg 2,4-D /L contenida en su presentación microformulada Dedalo Elite y luego de 48 h de exposición no se observaron modificaciones significativas en la actividad de enzima CAT. Contrariamente, sí se observó una disminución significativa en los individuos expuestos a Dedalo Elite durante 96 h. La actividad de GSH no varió significativamente en las larvas expuestas durante 48 h con respecto a los valores control, pero en las larvas expuestas durante 96 h la concentración de GSH disminuyó de manera significativa. Finalmente, La actividad de GST no se vió modificada de manera significativa en ninguno de los tiempos ensayados. Cuando se llevaron a cabo los ensayos con LCT y su respectivo microformulado Karate®, los resultados del EC en su variante alcalina revelaron que el p.a. indujo lesiones significativas en las concentraciones de 10 y 100 µg/ml mientras que el microformulado produjo daño en la cadena de ADN en todas las concentraciones ensayadas en el rango de 0,1-100 µg/ml. Tras la evaluación mediante el EC in vivo de la genotoxicidad inducida por una concentracion ambiental (0,0001 mg/L) del microformulado Karate® en eritrocitos de larvas de R. arenarum, los resultados demostraron que el compuesto fue capaz de ejercer daño en el ADN tras una exposición de 48 y 96 h. Tras el tratamiento de células CHO-K1 con LCT y Karate®, los resultados demostraron que LCT produjo un aumento significativo de la frecuencia de MNs después de la exposición con 10 y 100 µg/ml. En adición, aumentó significativamente la frecuencia de BNs cuando las células se expusieron a 1 y 10 µg/ml y la frecuencia de PNs para la concentración de 100 µg/ml. En cuando al IDN se observó una disminución significativa del mismo para las concentraciones de 10 y 100 µg/ml. En el caso de los tratamientos con Karate® no se observó un aumento significativo en la frecuencia de MNs, BNs ni PNs en los cultivos tratados. Los tratamientos de 10 y 100 µg/ml resultaron citotóxicos, lo que impidió registrar la frecuencia de MNs, la de anormalidades nucleares y los valores de IDN. Con relación a la citotoxicidad, los resultados obtenidos en el ensayo de RN tras la exposición de células CHO-K1 a LCT y Karate® indican que la actividad lisosomal no fue modificada significativamente por ninguna de las concentraciones ensayadas de LCT, mientras que cuando las células fueron expuestas a Karate® mostraron una inhibición significativa de la actividad lisosomal en el rango de concentraciones de 5-100 µg/ml. También en células CHO-K1 luego de la exposición a LCT y Karate® se observó que ninguna de las concentraciones empleadas (0,1-100 µg/ml) produjo una alteración significativa en la actividad mitocondrial cuando los cultivos fueron tratados con el p.a. Por otro lado, cuando se expusieron a Karate®, las células CHO-K1 mostraron una inhibición de la actividad mitocondrial para las concentraciones de 50 y 100 µg/ml. En el ensayo de muerte celular programada en los cultivos expuestos a 5 y 50 μg/ml de LCT y Karate®, los resultados obtenidos demostraron que en los tratamientos con LCT no se produjeron alteraciones significativas en las distintas proporciones de tipos celulares, mientras que cuando se empleó Karate® el tratamiento de 50 μg/ml produjo un incremento significativo en las células necróticas y de las células apoptóticas tempranas y de las tardías. Los resultados del EC modificado con enzimas de restricción en células CHO-K1 expuestas a LCT y Karate®, luego del tratamiento con la enzima Fpg se observó un aumento significativo del DO sólo luego de la exposición al microformulado. Cuando se realizó el tratamiento con Endo III, se observó que tanto el p.a. como su microformulado Karate® indujeron un aumento significativo del DO. Cuando se analizaron los resultados de los biomarcadores enzimáticos y no enzimáticos de estrés oxidativo, en larvas de R. arenarum expuestas a una concentración ambiental de 0,0001 mg LCT/L contenida en su presentación microformulada Karate®, se observó que la actividad de la enzima CAT aumentó significativamente en los individuos expuestos durante 48 h, mientras que, en los individuos expuestos durante 96 h, si bien también se observó un aumento de su actividad, el mismo no resultó significativo estadísticamente. La actividad de GSH en larvas expuestas durante 48 h disminuyó cuando se comparó con el grupo control, pero la misma no resultó significativa estadísticamente, mientras que en las larvas expuestas durante 96 h se observó un incremento significativo en la actividad de GSH. Por último, se observó un incremento significativo en la actividad de GST a las 48 h de tratamiento con Karate®, mientras que a las 96 h no hubo modificaciones significativas en la actividad de la enzima. Los resultados de la presente Tesis Doctoral demuestran la capacidad tanto de los p.a. 2,4-D y LCT como de sus microformulados Dedalo Elite y Karate® de inducir daño citotóxico en sistemas in vitro, daño genotóxico en sistemas tanto in vitro como in vivo y estrés oxidativo en sistemas in vitro. Teniendo en cuenta nuestros resultados y las conclusiones emitidas por las distintas organizaciones en relación con la toxicidad de los mismos, cabe destacar que es necesario continuar con la evaluación de los p.a. y de las variedades comerciales para lograr una caracterización integral de los efectos deletéreos.