Análisis de la interacción funcional entre las dos proteínas que unen lípidos coexpresadas en epitelio intestinal

Abstract

El estudio de los mecanismos moleculares por los cuales se asimilan nutrientes y se regula dicho proceso son temas de alto interés que aún no están completamente entendidos y que tienen gran relevancia para el desarrollo de terapias para enfermedades de relevancia social como la obesidad o la aterogénesis y sus complicaciones cardíacas. El objetivo de este trabajo se centró en evaluar la interacción funcional entre las FABP coexpresadas en epitelio intestinal. Para ello se expresaron y purificaron las proteínas recombinantes de rata IFABP y LFABP a partir de bacterias que contenían los plásmidos pET11a-rLFABP o pET11d-rIFABP. Antes de proceder al estudio propuesto propiamente dicho, se realizaron controles estructurales de unión de un análogo fluorescente de ácido graso, comprobándose que las proteínas obtenidas estaban bien plegadas y eran funcionales. Respecto a la interacción directa entre las FABP intestinales, en los ensayos realizados a las distintas concentraciones de proteínas marcadas, no se observó interacción por FRET. Como se mencionó anteriormente, esto no necesariamente significa que no existe interacciones entre estas FABP, sino que puede deberse a que el nivel de marcación (DOL) logrado para cada FABP fue bajo. De hecho, el grado de marcación alcanzado sólo permitiría ver menos del 20 % de las interacciones que se den, lo que nos limita considerablemente la sensibilidad del ensayo. Más aun, es posible que las interacciones que se den entre IFABP y LFABP sean de naturaleza transiente y no duren lo suficiente como para detectarlas por este método. Con el fin de estudiar la interacción transiente pero funcional entre las FABP, se realizaron ensayos de transferencia de ligando entre ellas, y se logró demostrar la transferencia de ligandos entre IFABP y LFABP. Sin embargo, no fue posible evaluar si el mecanismo de transferencia de 12AO era mediado por la disociación del ligando hacia la fase acuosa o si tenía como intermediario la interacción de ambas proteínas en un mecanismo colisional. Esto se debió en parte que fue necesario aplicar ajustes de mayor complejidad, respecto a los estudios clásicos de transferencia a membranas fosfolipídicas, para poder describir satisfactoriamente los procesos que tienen lugar durante la transferencia de ácidos grasos entre IFABP y LFABP. Este procedimiento llevó a contemplar la posibilidad de que coexistan hasta tres procesos independientes, ya sea porque las condiciones iniciales del ensayo no pudieron eliminar o minimizar la posibilidad de que ocurran fenómenos alternativos al que se deseaba estudiar o porque el sistema en realidad es polidisperso y es necesario considerar diferentes configuraciones de unión del 12AO a las FABP, observación que resulta completamente novedosa a la luz de la bibliografía disponible. Para finalizar, vale destacar que el estudio de los mecanismos de absorción de nutrientes y la regulación de su distribución hacia distintos destinos metabólicos es aún un tema de gran interés médico y tecnológico, pero que requiere de gran atención para resolver un gran número de interrogantes que aún no han sido resueltos, dentro de los cuales se encuentra identificar y describir las funciones específicas de las FABP que se coexpresan en niveles relativamente elevados en enterocitos, IFABP y LFABP.