Estudios sobre el significado del gen <i>gua</i>B de <i>R. tropici</i> en vida libre y en su interacción simbiótica con leguminosas hospedadoras

Abstract

En esta tesis se propone investigar el rol del gen guaB de los rizobios en el establecimiento de una simbiosis efectiva con las leguminosas hospedadoras y avanzar en el conocimiento actual de los factores genéticos y bioquímicos determinantes de la tolerancia al estrés térmico de R. tropici. Encontramos que el gen guaB de R. tropici mapea entre dos marcos de lectura activos cuyas secuencias no se encuentran relacionadas con genes de la vía de síntesis de guanina. El gen (ORF1) que precede a guaB codifica para una metalobetalactamasa, la organización ORF1-gen guaB se conserva en los rizobios S. meliloti, y A. tumefaciens. Asimismo, a diferencia de lo observado en E. coli, donde los genes gua se encuentran organizados en un operón guaBA, los genes gua de R. tropici se encuentran localizados en regiones cromosomales separadas. La expresión del gen guaB, en forma similar a otros genes que participan en vías biosintéticas, experimenta una regulación negativa por las purinas. Por otra parte, aunque es claro que R. tropici requiere guanina para crecer en condiciones de alta temperatura, el estrés térmico no actúa como un factor activante de la expresión del gen guaB, indicando que la expresión constitutiva de este gen es suficiente para mantener la síntesis de guanina requerida durante el crecimiento en condiciones de estrés. La ausencia de actividad IMPd no afecta, en tiempos cortos de estrés, la síntesis de proteínas de estrés térmico en R. tropici, incluyendo las proteínas DnaK y GroEL. Sin embargo, la síntesis de proteínas en períodos prolongados de estrés depende de la disponibilidad de guanina, lo que demuestra la importancia de la guanina en la fisiología celular durante las condiciones de shock térmico. En la interacción simbiótica, el requerimiento de la expresión del gen guaB, demostrado para R. tropici, no es un fenómeno generalizado entre los rizobios y probablemente se encuentra asociado con la ontogenia del nódulo, determinado o indeterminado, dado que la expresión del gen guaB es dispensable en las asociaciones de nódulos indeterminados como es el caso de los formados por leucaena o alfalfa, mientras que en las asociaciones con leguminosas tropicales que forman nódulos determinados, como lo son siratro, caupí, y poroto, el defecto en el gen guaB aparece ligado al fenotipo simbiótico defectivo. Estos resultados invitan a especular en la existencia de una señal generada por el rizobio -dependiente de guaB- necesaria para su liberación dentro de las células del nódulo determinado. Por otra parte, la ausencia de actividad IMPd pone de relieve potencialidades metabólicas propias de cada especie de rizobio que en uno u otro caso, se manifiestan alternativamente como fenotipos auxotróficos o prototróficos. El análisis de S. meliloti permitió demostrar que, de manera diferente a lo encontrado en R. tropici, la actividad Xdh no es suficiente para conferir un fenotipo prototrófico. Se puede asumir que la Xdh como enzima de vía alternativa tiene alcances funcionales diferentes entre estas especies, y que en el caso de R. tropici la eficiencia de esta vía de salvataje es mayor que en S. meliloti.