Caracterización, diferenciación e identificación de microorganismos por espectroscopía infrarroja-transformada de Fourier

Abstract

En los últimos 20 años se ha visto un importante crecimiento en el empleo de técnicas físicas rápidas, sensibles y de alta precisión para el análisis microbiología). Entre ellas se podrían mencionar la espectrometría de masas (MS), la espectroscopia molecular (Fluorescencia, Infrarrojo y Raman), y la aplicación de tecnologías de laser y citometría de flujo. Estas tecnologías han avanzado paralelamente al desarrollo de técnicas de genética molecular. Todas ellas, en conjunto, permitirán en un futuro cercano llevar a cabo una caracterización molecular microbiana completa, sensible y específica. El espectro infrarrojo (IR) de una célula microbiana intacta es considerado como una señal altamente específica que constituye una verdadera huella dactilar (fingerprint) que puede ser utilizada para: (1) diferenciar, clasificar e identificar poblaciones microbianas (a nivel de especies y cepas); (2) detectar componentes intracelulares "in situ" como cuerpos de inclusión, materiales de reserva y endoesporas, pilis, flagelos; (3) monitorear el crecimiento de microorganismos creciendo en medio líquido, sólido y en biofilm y procesos biotecnológicos en general; (4) caracterizar y cuantificar metabolitos producidos durante un cultivo; (5) analizar comparativamente diferentes estados fisiológicos de una misma población y (6) estudiar interacciones droga- células. La información necesaria para llevar a cabo estos estudios microbianos se encuentra distribuida a través de toda la región infrarroja (IR) del espectro electromagnético: IR cercano (NIR), medio (MIR) y lejano (FIR). Las bandas anchas típicas y los complejos contornos espectrales que caracterizan a los espectros de microorganismos, células, tejidos, y fluidos biológicos pueden ser sistemáticamente analizados aplicando técnicas de aumento de resolución (deconvolución y derivadas), diferencias espectrales, métodos de reconocimiento de patterns como análisis factorial y análisis de clusters, y redes neuronales artificiales (ANNs). La cuantificación de componentes celulares también puede llevarse a cabo a través de diversas técnicas: convencionales basadas en la ley de Lambert y Beer, como el cálculo de áreas o alturas de bandas espectrales o bien las basadas en técnicas de análisis multivariante cuantitativo, las cuales tienen en cuenta el pattern de todo él espectro o de su derivada. Aplicaciones adicionales de la espectroscopia infrarroja se han podido llevar a cabo con la aparición de la microcopia óptica acoplada a la espectrometría, que ha permitido obtener espectros infrarrojos de microcolonias (menos de 103 bacterias) provenientes de poblaciones puras o mixtas. Por medio de la utilización de un controlador digital del espacio x-y, y técnicas de mapeo y video se han podido detectar, diferenciar e identificar microorganismos en menos de 8 horas. En los últimos años se han combinado las dos espectroscopias vibracionales, (IR y Raman), lo cual junto con el desarrollo de software específicos para reconocimiento de patterns han abierto un amplio camino en la investigación de materiales biológicos.