Purificación y caracterización de poligalacturonasas de Aspergillus kawachii

Abstract

El desarrollo de nuevas aplicaciones de las pectinasas depende de la búsqueda de enzimas que catalizen reacciones novedosas o que presenten propiedades diferentes a las ya estudiadas. Considerando la capacidad de A. kawachii de producir enzimas activas en condiciones de alta acidez y al escaso conocimiento de su sistema pectolítico, se inició un proyecto de investigación dirigido a estudiar las pectinasas de este microorganismo. El presente trabajo de Tesis se enmarcó en los objetivos de dicho proyecto y se relacionó con el screening de actividades enzimáticas, la purificación y caracterización de una PGasa activa sobre sustratos solubles e insolubles a valores bajos de pH (2.0-3.0) y su aplicación a la extracción enzimática de pectina y la maceración de tejidos. El trabajo se extendió a la purificación y caracterización de poligalacturonasas no-ácidas y al estudio del fenómeno de adsorción selectiva de estas PGasas a filtros de fibra de vidrio. Dicho fenómeno fué observado durante los estudios preliminares de screening y constituyó un aporte original no previamente contemplado en los objetivos iniciales del proyecto. A continuación se detalla el plan desarrollado en el presente trabajo. - Screening de enzimas pectolíticas (Capítulo 2) Cultivos de A. kawachii en medios líquidos con diferentes fuentes de carbono para el screening de enzimas. Desarrollo de un test en placa y zimograma para detectar actividad frente a RG. Caracterización preliminar de la actividad solubilizadora de pectina. - Purificación y propiedades de una poligalacturonasa ácida (Capítulo 3) Purificación de una PGasa ácida (PGI) parcialmente constitutiva producida en un medio con glucosa. Determinación de sus propiedades fisico-químicas y cinéticas, modo de acción (exo/endo), estabilidad térmica y especificidad de sustrato. - Empleo de poligalacturonasas en procesos de extracción de pectina y maceración de tejidos vegetales (Capítulo 4) Ensayos de maceración de frutas y hortalizas y extracción de pectina de pomaza de limón con la PGI de A. kawachii. Comparación de la pectina extraída enzimáticamente a pH ácido con pectinas extraídas por métodos químicos y con PGasa de A. niger. Adsorción de PGasas no-ácidas de A. kawachii a filtros de fibra de vidrio. - Purificación y propiedades de las PGasas (Capítulo 5) Estudio del fenómeno de adsorción de pectinasas a filtros de fibra de vidrio. Purificación y caracterización de las PGasas involucradas en el proceso de adsorción.