Construcción de distintas formas multiméricas de un polímero similar a elastina (ELP) y estudio del efecto que ejercen en la acumulación de proteínas reporteras de retículo endoplásmico en Nicotiana benthamiana

Abstract

La fusión a polímeros similares a elastina (ELP) ha sido estudiada en los últimos años como estrategia para facilitar la recuperación de proteínas heterólogas de interés expresadas en distintos organismos. Trabajos previos indican que proteínas fusionadas a ELP se acumulan en cuerpos proteicos (PB) dentro del retículo endoplásmico (RE). El objetivo de este trabajo fue analizar el efecto de ELPs de distinta longitud (ELP1 n=36 y ELP2 n=72) sobre la acumulación de dos proteínas reporteras fluorescentes direccionadas a RE (GFP-ER y γ-RFP) a fin de evaluar si el stress generado por la presencia del ELP es capaz de activar mecanismos que mejoran la capacidad de la célula vegetal de sintetizar, plegar correctamente y transportar las proteínas reporteras. Para los ensayos se partió de la secuencia de ADN sintética de ELP1 que contiene 36 repeticiones de secuencias (VPGXG)n, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina y n es el número de unidades repetitivas del pentapéptido. Esta secuencia fue dimerizada a través de una estrategia de multimerización recursiva para luego transferirse al vector binario pGWB2. La construcción resultante se transformó en un cultivo de la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens que fue utilizado para transformar por agroinfiltración hojas de Nicotiana benthamiana, junto con combinaciones del supresor del silenciamiento post-transcripcional p19 (proveniente del virus Tomato Bushy Stunt Virus, TBSV) y de los reporteros GFP-ER y γCherry. La cinética de la expresión transitoria fue evaluada mediante microscopio estéreo de disección con filtros para fluorescencia analizándose el efecto de distintas cantidades reporteros, ELP y p19. Además por microscopía confocal se evaluó la formación de PBs. Se observó un patrón reticular en las células transformadas con p19 y el reportero, mientras que en presencia del ELP2 se observó la presencia de PB móviles. Esto prueba que la sobreexpresión en N. benthamiana de ELP sintéticos direccionados al retículo endoplásmico (RE) capaz per se de producir un stress tal que modifique la acumulación de una proteína de interés aunque esta no se encuentre fusionada al ELP.