Análisis de la interacción de proteínas que unen ácidos grasos con membranas

Abstract

Las proteínas que unen ácidos grasos de intestino (IFABP) e hígado (LFABP), son proteínas homólogas que se coexpresan en altos niveles en el citosol de células del epitelio intestinal. Ambas proteínas poseen una estructura típica que consta de 10 cadenas beta antiparalelas empaquetadas formando un barril beta levemente elíptico y dos segmentos alfa-helicoidales cortos que formarían parte de un pequeño portal en la parte superior del barril. Pese a que estas dos proteínas presentan una estructura tridimensional muy similar, poseen un bajo nivel de homología en su estructura primaria. Si bien tanto IFABP como LFABP son capaces de unir ácidos grasos, presentan una serie de diferencias en cuanto al número de sitios de unión, tipo de ligandos y afinidad por los mismos. Por otra parte, estas proteínas emplean diferentes mecanismos de transferencia de ácidos grasos hacia membranas. La transferencia de ácidos grasos desde IFABP ocurre durante una interacción colisional entre la proteína y la membrana aceptora, mientras que LFABP transfiere los ácidos grasos mediante un mecanismo mediado por difusión acuosa. Más aún, se ha demostrado que el dominio α-helicoidal de IFABP desempeña un rol crítico en la determinación de mecanismo de transferencia de los ácidos grasos de tipo colisional. Tomando como base estas diferencias estructurales, de unión y de cinética de transferencia del ligando, se ha propuesto que I- y LFABP tendrían funciones diferentes dentro del enterocito, tal vez contribuyendo al transporte diferencial y compartimentación de los lípidos. Con la finalidad de contribuir al descubrimiento de las funciones específicas de I- y LFABP en el enterocito, en este proyecto se han abordado los siguientes objetivos específicos: a) Analizar la unión, partición de equilibrio entre proteína y membrana, velocidades y mecanismos de transferencia de diversos ligandos naturales desde LFABP hacia vesículas artificiales. b) Analizar la interacción física de la región portal de IFABP con la bicapa fosfolipídica y determinar qué factores modulan dicha interacción. LFABP presenta características particulares dentro de la familia de las FABPs. Puede unir más de un ácido graso de cadena larga y, además, es capaz de ligar una variedad de ligandos hidrofóbicos como Acil-CoAs, monoglicéridos y sales biliares, entre otros. A su vez, como ya ha sido mencionado, presenta un mecanismo “difusional” de transferencia de análogos fluorescentes de ácidos grasos hacia membranas. Mediante el empleo de mutantes puntuales de triptófano de LFABP, cuya intensidad de emisión fluorescente es sensible a la unión del ligando, nos ha sido posible medir directamente la afinidad de unión, la partición de equilibrio y la transferencia hacia membranas modelo de ligandos naturales, en lugar de los análogos fluorescentes utilizados hasta el momento. Los resultados de unión de ligandos naturales a LFABP muestran que, mientras los ácidos grasos se unen a través de un mecanismo cooperativo, sus respectivos acil-CoAs presentan un comportamiento hiperbólico no cooperativo. Respecto a la partición de equilibrio entre la proteína y membranas fosfolipídicas, los ácidos grasos saturados parecen tener una mayor partición hacia la fase proteica respecto a la fase lipídica comparada con los ácidos grasos insaturados. En cuanto a la cinética de transferencia de los ligandos naturales, éstos muestran velocidades doscientas veces más rápidas que las halladas para los análogos fluorescentes. Cabe destacar que el oleoil-CoA presenta un comportamiento de transferencia marcadamente distinto al resto de los ligandos estudiados, probablemente indicando la posibilidad de LFABP de orientar distintos ligandos hacia diferentes destinos metabólicos. Por otro lado, se ha propuesto que la transferencia de los ácidos grasos desde IFABP hacia vesículas ocurre mediante interacciones proteínamembrana. En este trabajo, hemos analizado la profundidad de penetración de la proteína IFABP en la bicapa lipídica. Para ello, se han construido una serie de mutantes puntuales de triptófano de IFABP ubicados estratégicamente en la región portal. Empleando ensayos de quenching de la fluorescencia del triptófano de los mutantes puntuales por vesículas construídas con lípidos brominados, en los cuales el bromo se ubica en distintas posiciones dentro de la bicapa lipídica, se puede determinar la profundidad a la cual se localiza el residuo de triptófano en la membrana. También se analizó cómo esta interacción IFABP-membrana es afectada por la carga negativa superficial de la membrana y por la fuerza iónica del medio. Los resultados muestran claramente que la región portal de IFABP es el dominio de unión a membrana y que las cargas negativas de la superficie de las vesículas y las positivas superficiales de la proteína son importantes para establecer el “complejo colisional” proteína-membrana. De esta manera, las interacciones electrostáticas entre IFABP y las membranas jugarían un rol primordial en la formación del complejo, seguidamente, interacciones hidrofóbicas, mediarían la inserción parcial de la proteína en la fase lipídica.