Caracterización de la interacción de lipopolisacáridos bacterianos con proteínas y membranas

Abstract

El objetivo principal de este trabajo de tesis es caracterizar desde el punto de vista biofísico y biológico la interacción de LPS con membranas lipídicas y proteínas con la finalidad de dilucidar los parámetros que determinan una mayor eficiencia en el proceso de neutralización del efecto endotóxico. Para esto se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1- Caracterizar desde el punto de vista biofísico el efecto del LPS sobre el proceso de micelización de membranas inducido por apo AI, por medio de técnicas espectroscópicas y de electroforesis, analizando tanto la interacción proteína-LPS como membrana-LPS. 2- Estudiar si el LPS presente en medio acuoso se asocia a membranas aún en ausencia de LBP. A su vez se evaluará si se produce una intercalación de LPS en la matriz hidrofóbica de membranas de diferente composición lipídica por medidas de la eficiencia de transferencia de energía entre derivados fluorescentes de fosfolípidos incorporados en la membrana. 3-Caracterizar por técnicas de microscopía bifotónica empleando la sonda fluorescente Laurdan la formación de dominios de LPS incorporado en la membrana. 4- Caracterizar la interacción de apo AI-LPS evaluando los cambios conformacionales de la proteína por medidas de fluorescencia intrínseca, los parámetros característicos del proceso de desnaturalización por cloruro de guanidinio y el proceso de digestión tríptica. Finalmente, por uso de reactivos fotoactivables y digestión química con bromuro de cianógeno se determinará la mínima región de la proteína que interacciona con LPS. 5- Evaluar mediante ELISA la capacidad de reducir la producción de citoquinas (TNF-α) por parte de liposomas, apo AI y el mínimo fragmento de apo AI que une LPS.