Estudio de señales de direccionamiento vacuolar del receptor AtRMR1 y su aplicación en la expresión de un anticuerpo recombinante en plantas

Abstract

Existe una creciente necesidad de desarrollo de plataformas de producción, a gran escala y de bajo costo, de anticuerpos completos, de manera de satisfacer sus demandas en los distintos tipos de aplicaciones, terapéuticas o diagnósticas. Las plantas son potencialmente el sistema de producción más económico, sin embargo todavía hay que superar varios obstáculos, entre ellos la degradación proteolítica que impacta sobre la calidad y los niveles de acumulación de los anticuerpos producidos. En este trabajo se desarrolló y evaluó una estrategia de direccionamiento a vacuolas de reserva como método para mejorar la acumulación de inmunoglobulinas en células vegetales. Para este estudio, se partió de hibridomas que producían los anticuerpos 1B4E9 y 3B4H1 específicos de prolaminas y 2G3 específico de transglutaminasa tisular humana (htTG). Estos anticuerpos monoclonales fueron escogidos como modelos de inmunoglobulinas de ratón por sus aplicaciones en diagnóstico. Se realizó el clonado molecular de estas inmunoglobulinas y luego realizó los subclonados en vectores de expresión bacterianos para verificar su funcionalidad. Por otro lado, a fin de identificar señales que permitieran un direccionamiento vacuolar más eficiente se realizó una disección funcional del receptor AtRMR1, generando una construcción reportera, que contenía la proteína fluorescente roja (RFP) y los dominios transmembrana y citosólico (TMCT) del receptor AtRMR1 denominada RFP-TMCT, que fue evaluada por expresión transiente en tabaco y estable en arabidopsis. Se demostró que los dominios TMCT del receptor AtRMR1 son suficientes para dirigir a RFP a vacuola central en hojas y raíces y a vacuola de almacenamiento proteico en semillas. Además, los estudios bioquímicos indicaron que RFP-TMCT se encuentra asociada a microsomas y se comporta como una proteína integral de membrana. Posteriormente al llegar a vacuola central, RFP-TMCT se internaliza, acumulándose de manera estable en hojas. Los genes codificantes para las regiones variables del anticuerpo 2G3 fueron fusionadas a las secuencias codificantes para las regiones constantes kappa de la cadena liviana (2G3-LC) y gamma 1 de la cadena pesada de ratón (2G3-HC) y a RFP, generando 2G3-LC-RFP y 2G3-HC-RFP, respectivamente. Se prepararon tres versiones de la construcción 2G3-HC-RFP: secretoria (2G3-HC-RFP), vacuolar con la señal de direccionamiento carboxilo terminal de la faseolina (2G3-HC-RFP-AFVY) y vacuolar con las regiones de AtRMR1 estudiadas (2G3-HC-RFP-TMCT). Estas construcciones fueron co-expresadas temporalmente en hojas de Nicotiana benthamiana, en presencia de los supresores de silenciamiento postranscripcional p19 y Hc-Pro. Por microscopia confocal se determinó que 2G3-Ig-RFP (2G3-LC-RFP y 2G3-HC-RFP) presenta principalmente un patrón típico de apoplasto, mientras que 2G3-Ig-RFP-AFVY (2G3-LC-RFP y 2G3-HCAFVY) y que 2G3-Ig-RFP-TMCT (2G3-LC-RFP y 2G3-HC-RFP-TMCT) se encuentran en vacuola central. Este patrón es diferente del obtenido para la expresión de las cadenas individuales livianas y pesadas ya que 2G3-LC-RFP localiza en apoplasto y 2G3-HC-RFP presenta un patrón típico de retículo endoplásmico que es consistente con el modelo del proceso de ensamblado de anticuerpos, en donde la cadena pesada queda retenida en retículo endoplasmático sino adquiere su plegamiento correcto, que ocurre cuando se ensambla con la cadena liviana. Estas modificaciones en la localización sugieren un plegamiento de la inmunoglobulina que aunque esta fusionada a cuatro moléculas de RFP es capaz de avanzar en la vía secretoria. Los niveles de acumulación del anticuerpo fueron mayores cuando se empleó la señal de direccionamiento AFVY, que los obtenidos para la versión secretoria y la fusionada a TMCT del receptor AtRMR1. Los resultados mostrados en este trabajo, sugieren que el direccionamiento vacuolar es una estrategia adecuada para evitar la degradación de inmunoglobulinas en el apoplasto incrementándose los niveles de acumulación, y también que las células vegetales son capaces de producir anticuerpos fusionados a proteínas fluorescentes lo que puede facilitar la obtención de inmunoglobulinas fluorescentes con alta actividad específica.