Efectos del tratamiento oral con inhibidores de dipeptidilpeptidasa-4 y biguanidas sobre el metabolismo óseo

Abstract

La Diabetes mellitus (DM) es un síndrome hiperglucémico que afecta al 7% de la población adulta de nuestro país, y que a largo plazo se asocia con complicaciones macro- y micro-vasculares potencialmente discapacitantes. Algunas de estas complicaciones crónicas (aterosclerosis, nefropatía, retinopatía, neuropatía) constituyen las principales causas de morbilidad y mortalidad en pacientes con DM, y por ello se han estudiado sus mecanismos patogénicos con detalle. Sin embargo, existen otras complicaciones tales como las óseas y articulares, que han recibido menor atención en la literatura, pero que contribuyen a disminuir la calidad de vida de los pacientes. En particular, se ha encontrado que a largo plazo, la DM se asocia con pérdida de masa ósea (osteopenia, osteoporosis) y/o disminución en la calidad estructural del hueso, que genera un incremento en el riesgo de fracturas en el esqueleto apendicular.Los pacientes con DM tipo 2 son frecuentemente tratados con antidiabéticos orales (sulfonilureas, biguanidas, tiazolidindionas [TZD] y/o inhibidores de la dipeptidil-peptidasa-4 [DPP-4]), con el objeto de poder lograr un mejor control glucémico. Resulta entonces de interés investigar el posible efecto directo o indirecto de estos antidiabéticos orales sobre el metabolismo óseo, particularmente en vista del efecto deletéreo per se de la DM sobre el hueso. A lo largo de los últimos años nuestro grupo ha estudiado el efecto de la metformina (una biguanida insulinosensibilizante) sobre osteoblastos en cultivo, encontrando que induce en forma directa un incremento en su proliferación, diferenciación y mineralización. En experimentos más recientes, encontramos además que al administrar metformina en el agua de bebida a ratas diabéticas y no diabéticas, induce un efecto osteogénico tanto in vivo (aumentando la masa y celularidad ósea, e incrementando la reparación de una lesión ósea inducida previamente) como ex vivo (estimulando la capacidad osteogénica de células progenitoras de médula ósea aisladas del canal medular diafisario de huesos largos). La dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4) es una proteasa de acción extracelular, responsable de la degradación de una familia de hormonas denominadas incretinas, entre las cuales se encuentran el péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP), y los péptidos símil-glucagón tipos 1 (GLP-1). Estas incretinas inducen un estímulo sobre la secreción pancreática de insulina, habiéndose estimado que dan cuenta del 50% de dicha secreción de insulina luego de la ingesta oral de alimentos pero tienen una vida media corta en circulación (1-2 minutos), debido a su rápida degradación por la DPP-4. Se han desarrollado inhibidores selectivos de DPP-4 (sitagliptina, vildagliptina, saxagliptina) para poder incrementar la secreción de insulina estimulada por incretinas en pacientes con DM tipo 2, con el objeto de mejorar su control glucémico post-prandial. El efecto de los diferentes inhibidores de la DPP-4 sobre el metabolismo óseo aún no se ha establecido con claridad. Sin embargo, en estudios con pacientes diabéticos de 24 semanas de duración se encontró que el tratamiento con saxagliptina indujo un incremento de un 67% en la incidencia de fracturas respecto de placebo,dato que se encuentra en elprospecto publicado por la compañía farmacéutica.En base a esta información, se propone para este trabajo de tesis lahipótesis de que la monoterapia con saxagliptina induce efectos deletéreos sobre el hueso, y que dichos efectos pueden prevenirse por el co-tratamiento con metformina. Se investigó el efecto de un tratamiento oral con saxagliptina y/o metformina sobre la micro-arquitectura de huesos largos en ratas control (no diabéticas) y diabéticas, utilizando un modelo animal de ratas con hiperglucemia generada por deficiencia parcial en la producción y secreción de insulina, como consecuencia de la destrucción parcial de las células β del páncreas.Se estudiaron las metáfisis proximales de los fémures, para ello se realizaron cortes histológicos que fueron coloreados con hematoxilina y eosina (H-E) y con Azul Alcian (AA). Además la presencia de osteoclastos se puso en evidencia mediante, la reacción histoquímica fosfatasa ácido tartrato resistente (TRAP). Con el fin de estudiar su mecanismo de acción, se evaluó in vitro el efecto directo de la saxagliptina y su combinación con metformina sobre una línea celular pre-osteoblástica (MC3T3E1) y sobre células progenitoras de médula ósea (CPMO) aisladas del canal medular de ratas no diabéticas. Se realizaron ensayos de proliferación en presencia de mitógenos (Suero Fetal Bovino, Insulina e IGF-1) durante 24hs y ensayos de diferenciación celular hacia el linaje osteoblástico durante 14 o 21 días. Adicionalmente, mediante western blot se determinaron factores de diferenciación tales como Runx-2 y osteocalcina (comprometidos con la osteogénesis), PPARγ (un factor de transcripción adipogénico), las señales mitogénicas mediadas por las quinasas reguladas extracelularmente (ERK) y la activación de la quinasa dependiente de AMPc (AMPK). Al evaluar parámetros histomorfométricos estáticos en los fémures de ratas sanas, encontramos que la saxagliptina indujo efectos deletéreos en la micro-arquitectura del hueso trabecular femoral, que fueron prevenidos cuando se administra conjuntamente con la metformina. En los animales con deficiencia parcial en la secreción de insulina, el análisis de los fémures mostró un gran deterioro del tejido óseo, efecto propio de la enfermedad. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en los parámetros histomorfométricos de fémures de las ratas diabéticas tratadas con saxagliptina respecto a las diabéticas sin tratamiento; mientras que la administración de monoterapia con metformina previno completamente el efecto deletéreo sobre el tejido óseo. Cuando se evaluaron los fémures de estas mismas ratas, pero que fueron tratadas con la combinación saxagliptina-metformina, la mayoría de los parámetros histomorfométricos estudiados alcanzó valores similares a las ratas no diabéticas, sin tratamiento, es decir que mejoró la calidad ósea. Estudios in vitro realizados a corto plazo (24 h) mostraron que la saxagliptina inhibe la proliferación osteoblástica inducida por FBS, insulina e IGF-1 de las células MC3T3E1 y las CPMO; este efecto se encuentra mediado por la activación mediante fosforilación de ERK. Por el contrario, en ausencia de suero o factores de crecimiento la saxagliptina no tuvo ningún efecto per se sobre la proliferación de ambos tipos de células o la activación de ERK. Mientras que en los ensayos realizados a plazos más largo (2-3 semanas demostraron que al añadir saxagliptina al medio de cultivo hay unainhibición tipo dosis-dependiente de la secreción de colágeno tipo 1 y la producción de nódulos de mineralización, así como también una disminución de la expresión de osteocalcina y Runx-2, y un aumento de la expresión de PPARγ en ambos tipos celulares. Por otro lado, previamente hemos demostrado que la metformina tiene efectos osteogénicos directos, incrementando tanto la proliferación y como diferenciación osteoblástica e inhibiendo la diferenciación adipogénica. En el presente trabajo encontramos que la co-incubación de las células en presencia de saxagliptina y metformina previno los efectos negativos en la proliferación y diferenciación celular provocados por el inhibidor de DPP-4. La AMPK es una enzima involucrada en el metabolismo energético de la cual se ha demostrado su importancia en el desarrollo y diferenciación osteoblástica. Previamente hemos demostrado que el mecanismo de acción de la metformina se encuentra mediado por la AMPK, por este motivo investigamos si la monoterapia con saxagliptina o la terapia combinada eran capaces de afectar la activación de esta enzima, encontrando que la activación mediada por metformina no se afecta por el tratamiento con saxagliptina. Resumiendo, este modelo animal junto con los ensayos in vitro realizados, nos ha permitido poner a prueba nuestra hipótesis mostrando que la saxagliptina puede disminuir simultáneamente el compromiso osteoblástico y potencial osteogénico de las células progenitoras de médula ósea y afectar en forma directa la actividad osteoblástica; así como también puede inducir cambios perjudiciales en la microarquitectura de hueso trabecular femoral. Estos efectos fueron prevenidos total o parcialmente con el tratamiento combinado saxagliptina-metformina.