Mecanismos de acción de intervenciones cardioprotectoras durante la isquemia y la reperfusión en ratas normales e hipertróficas

Abstract

En estudios previos realizados en ratas hipertensas espontáneas (SHR) seniles se mostró que los corazones poseen una aumentada susceptibilidad al daño por isquemia- reperfusión (l-R). Sin embargo, cuando se utilizaron corazones hipertróficos de animales adultos jóvenes la respuesta a la l-R fue variable, mostrando una similar ó menor tolerancia a la isquemia que los animales normotensos. La sobrecarga intracelular de Ca2+ y la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) son las dos hipótesis que permiten explicar las alteraciones miocárdicas derivadas de la l-R (atontamiento, infarto y arritmias). De acuerdo a investigaciones recientes estos factores son capaces de desencadenar la formación del poro de permeabilidad transitoria de la mitocondria (mPTP), de cuya apertura depende el daño miocárdico. En la búsqueda de herramientas cardioprotectoras, en el año 1986, se observó que la aplicación de isquemias cortas previamente a una isquemia más prolongada logra disminuir las alteraciones miocárdicas ocasionados por la l-R. A este fenómeno se lo llamó "preacondicionamiento isquémico" (Pl). Existen numerosos trabajos en animales normotensos que explican los mecanismos del Pl. Sin embargo, en animales hipertensos y específicamente en SHR la información es escasa. Por lo tanto, los objetivos de este trabajo de tesis fueron: 1.- determinar la respuesta miocárdica y el estrés oxidativo frente a isquemias de distinta duración en SHR y ratas normotensas Wistar Kyoto (WKY) de 5 a 6 meses de edad y 2.- examinar los efectos del Pl sobre las variables mencionadas y los mecanismos implicados, poniendo énfasis en la participación del óxido nítrico (NO), los canales mitocondhales de K+ dependientes de ATP (mitoK+-ATp) y la incidencia sobre el mPTP. Se utilizaron corazones aislados y perfundidos por el sistema de Langendorff en los cuales después de un período de estabilización de 20 min se realizaron los siguientes protocolos experimentales: 1) 3hs de perfusión; 2) 35min de isquemia global (IG) y 2 hs de R; 3) 50min de IG y 2hs de R; 4) 1PI: 1 ciclo de 5min de IG y 10min de R previos a la IG de 35 min y 5) 3PI: 3 ciclos de 2min de IG y 5min de R previos a la IG de 50 min. Para investigar la participación del NO y de los mitoK+-ATP ambos protocolos de PI (1PI y 3PI) fueron repetidos en presencia del bloqueante de la óxido nítrico sintetasa (NOS) L-NAME (NG-nitro-L-arginina metil áster), ó del bloqueante de los canales mitoK+-ATP 5-HD (5-hidroxidecanoato). Para evaluar los efectos de las ROS en nuestro modelo experimental se utilizó un atrapante de dichas especies, el N-2-mercaptopropionil glicina (MPG). Al finalizar cada protocolo experimental se determinó el tamaño del infarto (TI) y, en los homogenatos cardíacos, la concentración de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), el contenido de glutatión reducido (GSH) y la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD). El estado de apertura del mPTP fue evaluado a través de la medida de la actividad citosólica de la enzima mitocondrial SODMn. La aplicación de 35 min de IG y 2 hs de R produjo un TI de aproximadamente 30% en las ratas WKY y SHR. La concentración de TBARS sólo aumentó en las SHR. El contenido de GSH disminuyó y la actividad de SOD y SODMn aumentaron en ambas cepas. Cuando la IG fue de 50 min, el TI en SHR fue mayor (^ 60%) que el observado en las ratas WKY (40%). La concentración de TBARS y la actividad de SOD aumentaron sólo en SHR. El contenido de GSH disminuyó y la actividad citosólica de SODMn aumentó en ambas cepas. Cuando se realizó el protocolo 1PI previo a la isquemia global de 35 min de duración, el TI disminuyó. Las TBARS disminuyeron sólo en SHR. El contenido de GSH aumentó y la actividad citosólica de SOD y SODMn disminuyó en ambas cepas. Con la aplicación de 1PI en WKY ó 3PI en SHR antes de la IG de 50 min y 2 hs de R, se observó disminución del TI en ambas cepas de ratas. Las TBARS no cambiaron, el contenido de GSH aumentó y la actividad citosólica de SODMn disminuyó en ambas cepas, pero la actividad de SOD sólo disminuyó en las SHR. En SHR, cuando se realizó el Pl en presencia de L-NAME en los dos períodos de IG (35 y 50 min), el TI fue similar al obtenido en los corazones no preacondicionados. La concentración de TBARS y la actividad citosólica de SOD y SODMn aumentaron, mientras que el contenido de GSH disminuyó. Sin embargo en las WKY, el bloqueo de la NOS, sólo modificó el efecto protector del Pl cuando la IG fue de 50 min. El bloqueo de los mitoK+-ATP en los corazones preacondicionados en los dos períodos de IG de las SHR y cuando la IG fue de mayor duración en las WKY, aumentó el TI y el nivel de las TBARS se incrementó o no cambió significativamente. El contenido de GSH disminuyó y la actividad citosólica de las enzimas SOD y SODMn aumentaron sólo en las SHR. En ambas cepas el tratamiento con MPG, en presencia de IG de 50 min, disminuyó el TI, la concentración de TBARS no se modificó y el contenido de GSH aumentó. La actividad citosólica de SOD y SODMn disminuyó sólo en SHR. Del análisis de los resultados presentados pueden extraerse las siguientes conclusiones: 1.- La respuesta del miocardio de las SHR adultas jóvenes comparada a la observada en ratas normotensas WKY de la misma edad cambia según la duración de la isquemia. En SHR la tolerancia es menor y la muerte celular es mayor que en las WKY cuando el período de isquemia se prolonga. 2.- En SHR, aunque la actividad de SOD aumentó y el sistema antioxidante GSH disminuyó, estos cambios no fueron suficientes para impedir el daño oxidativo, observándose un aumento de la peroxidación lipídica respecto a lo obtenido en las ratas WKY. 3.- En ambos protocolos de l-R y en las dos cepas (WKY y SHR) la actividad citosólica de SODMn aumentó, lo que sugiere que en dicha situación ocurrió la apertura del mPTP. 4.- Si bien el Pl ejerció efecto protector frente a las dos isquemias realizadas (35 y 50 min) en ambas cepas de ratas, fue necesaria la aplicación de un mayor número de ciclos preacondicionantes (en nuestro caso 3) en los corazones hipertróficos de las SHR cuando la isquemia fue de mayor duración. 5.- El Pl disminuyó el estrés oxidativo en ambas cepas, lo que fue evidente porque aumentaron los niveles de GSH y disminuyó la actividad de la enzima SOD. 6.- La actividad citosólica de la SODMn disminuyó en los corazones preacondicionados, sugiriendo que en estos corazones la apertura del mPTP fue menor. 7.- En las SHR, el NO y los mitoK+-ATP participan en los efectos beneficiosos del Pl frente a las isquemias de 35 y 50 min. En cambio, en las ratas normotensas WKY, ambos mediadores participan en el Pl sólo cuando la isquemia fue de mayor duración. 8.- En ambas cepas, el tratamiento con MPG ejerció efecto cardioprotector diminuyendo el TI y el estrés oxidativo. La menor actividad citosólica de SODMn con este tratamiento sugiere que la apertura del mPTP disminuyó. El preacondicionamiento isquémico tanto en ratas hipertensas espontáneas (SHR) como en normotensas WKY disminuyó las alteraciones irreversibles producidas por la isquemia-reperfusión. En corazones hipertróficos la vía del efecto protector del Pl frente a períodos isquémicos de 35 y 50 min involucra la participación del NO y de los canales mitocondriales de K+ dependientes de ATP, cuya apertura promueve la entrada de K+ a la mitocondria, lo que produciría una disminución de la apertura del mPTP. Esta menor apertura llevaría a una menor liberación de ROS al citosol y la consecuente disminución del daño oxidativo observado en corazones preacondicionados. En cambio, en corazones normotróficos, ambos mediadores aparecen significativamente involucrados en el Pl sólo cuando la isquemia fue de 50 min. Por otra parte, el efecto cardioprotector obtenido en los corazones de ambas cepas tratados con un atrapante de ROS, que fue similar al obtenido con el Pl, pone de manifiesto el papel injurioso que los ROS desempeñan en nuestro modelo de isquemia-reperfusión como determinantes de la pérdida de la integridad mitocondrial.