La senescencia foliar como factor de resistencia a la sequía en la soja (Glycine max L. Merr.)

Abstract

El objetivo general de esta tesis fue determinar el papel de la senescencia foliar en la tolerancia de las plantas superiores al déficit hídrico. La aproximación experimental consistió en comparar la respuesta a la sequía de líneas casi isogénicas de soja que senescen normalmente (genotipo silvestre, ggD1D1D2D2) o con mutaciones que provocan un fenotipo stay green (genotipo GGd1d1d2d2). La combinación al estado homocigota de los genes G (dominante) y d1 y d2 (recesivos) provoca la inhibición de un amplio espectro del síndrome de senescencia foliar, manteniendo la integridad del cloroplasto cuando en el genotipo silvestre se han degradado la mayor parte de los componentes del estroma y la membrana tilacoidal. Sin embargo, se comprobó que la combinación al estado homocigota recesivo de los genes d1 y d2 también provoca una mayor sensibilidad a la sequía. Ante una situación de estrés hídrico, las hojas del mutante d1d1d2d2 (con o sin G) experimentan una deshidratación irreversible a niveles de estrés mucho menores que los necesarios para causar el mismo fenómeno en el genotipo silvestre. La deshidratación comienza en los bordes de la hoja y luego se extiende hacia el resto de la lámina, primero en las hojas basales y luego progresa hacia las apicales. La deshidratación de las hojas de GGd1d1d2d2 ocurre tanto en plántulas como en plantas al estado reproductivo sometidas a sequía. Un fenómeno similar se observa en plantas con adecuado suministro hídrico al final del ciclo vital. En el genotipo silvestre, en cambio, las hojas abscinden al final del ciclo con un alto grado de hidratura. Se efectuaron varios experimentos con el objetivo de caracterizar cuantitativamente la respuesta a la sequía del genotipo silvestre (cv. Clark) y del mutante stay green GGd1d1d2d2, a través de la medición de indicadores del estado hídrico de las hojas. El contenido relativo de agua (CRA) y el potencial agua de las hojas del mutante sometidas a un período de estrés hídrico declinaron mas rápidamente que en el genotipo silvestre. Sin embargo, la conductancia estomática disminuyó en forma semejante en las plantas de GGd1d1d2d2 y del genotipo silvestre. Tampoco hubo diferencias en el potencial soluto en el estado de hidratación máxima de hojas de plántulas de Clark y GGd1d1d2d2 sometidas previamente a sequía. Estas observaciones indican que la mayor sensibilidad a la sequía en GGd1d1d2d2 no se debe a diferencias en la capacidad para el ajuste osmótico o cierre estomático. La deshidratación de las hojas del mutante podría explicarse por una obstrucción permanente del xilema que impidiera el flujo de agua durante la sequía y luego de reasumidas las condiciones de adecuado suministro hídrico. Para probar esta hipótesis, se realizaron experimentos donde se midieron el CRA, el contenido porcentual de agua y el potencial agua de plántulas de Clark y GGd1d1d2d2 sometidas a sequía y luego rehidratadas. En estos experimentos se encontró que los indicadores del estado hídrico se recuperan en pocas horas a niveles semejantes en las hojas de Clark y en las de GGd1d1d2d2 que se han deshidratado parcialmente. De estos experimentos se puede deducir que la deshidratación de las hojas de GGd1d1d2d2 no se debe a que una obstrucción permanente del xilema impida el flujo de agua. La aplicación exógena de ácido abscísico causó una marcada reducción de la conductancia estomática tanto en el genotipo silvestre como en GGd1d1d2d2. Sin embargo, la aplicación exógena de ácido abscísico no evita la deshidratación de las hojas de GGd1d1d2d2, ni revierte el fenotipo stay green del mutante. De estos experimentos se puede concluir que la mayor sensibilidad de GGd1d1d2d2 a la sequía probablemente no está relacionada con alteraciones en la percepción, sensibilidad o biosíntesis del ácido abscísico. Dado que no se encontraron diferencias en la respuesta de la conductancia estomática de Clark y GGd1d1d2d2 frente al estrés hídrico, se examinó la pérdida de agua del mutante a través de la cutícula, midiendo la pérdida de agua de hojas mantenidas en la oscuridad y a elevada concentración de CO2, situación en la cual los estomas están cerrados. Debido a que las hojas de soja son anfiestomáticas y es imposible descartar totalmente la pérdida de agua a través de los estomas, la pérdida de agua en oscuridad y a alta concentración de CO2 se menciona aquí como transpiración superficial mínima en lugar de transpiración cuticular, reservando este último término para las superficies foliares desprovistas de estomas. La transpiración superficial mínima (Tsm) disminuyó durante la sequía en las plantas del genotipo silvestre. En GGd1d1d2d2 la disminución de la Tsm durante el tratamiento de estrés fue mucho menor. Es posible que la mayor Tsm en GGd1d1d2d2 sea debida a alteraciones en la deposición de ceras epicuticulares. Pero observaciones con el microscopio electrónico de barrido no mostraron diferencias en la morfología de las ceras epicuticulares entre el mutante y el genotipo silvestre. Para comprobar cuál (o cuales) de las mutaciones que causan el fenotipo stay green determinan la mayor sensibilidad a la sequía del mutante, se realizaron experimentos utilizando líneas casi isogénicas con diferentes combinaciones de los genes G, d1 y d2. Las plantas de todas las isolíneas fueron sometidas a sequía y se midió su contenido relativo de agua. Se encontró que las isolíneas que portaban los genes d1 y d2 al estado homocigota recesivo, al ser sometidas a estrés hídrico, experimentan la deshidratación irreversible de sus hojas. De estos experimentos se puede concluir que los genes causantes de la mayor sensibilidad a la sequía del mutante son d1 y d2 combinados. Además de los efectos sobre la tolerancia al estrés, las mutaciones que causan el fenotipo stay green también tienen efectos pleiotrópicos sobre el rendimiento en semillas en condiciones naturales. En estas condiciones el rendimiento fue menor en GGd1d1d2d2 que en el genotipo silvestre. Experimentos previos mostraron que el rendimiento de plantas cultivadas en cámaras de crecimiento era mayor en GGd1d1d2d2, debido probablemente a que el mutante prolonga su actividad fotosintética porque mantiene la integridad del cloroplasto. La actividad fotosintética no resulta prolongada en GGd1d1d2d2 en condiciones naturales, probablemente debido a que el mutante experimenta estrés hídrico en condiciones naturales aún con adecuada disponibilidad hídrica. Esto no sucede en cámaras de crecimiento donde las condiciones de humedad, temperatura e irradiancia son menos extremas que a la intemperie durante la estación normal de crecimiento de la soja. El resultado mas importante hallado en esta tesis es que la combinación de genes que causan el fenotipo stay green en soja provocan también una mayor sensibilidad a la sequía. Esta vinculación entre la senescencia y la tolerancia a la sequía no ha sido encontrada en otros mutantes stay green. Los datos obtenidos sugieren que los genes d1 y d2 se encuentran en un punto de una cadena de transducción de señales donde convergen la senescencia foliar y algunas respuestas al estrés hídrico. En esta tesis se realizó una extensa caracterización fisiológica del comportamiento del mutante GGd1d1d2d2 ante la sequía. Queda pendiente determinar cuáles genes de resistencia a la sequía son controlados por G, d1 y d2 como un primer paso del camino que conduzca a dilucidar la interrelación genética entre la senescencia foliar y las respuestas de las plantas al estrés hídrico.