Estudio de los sistemas de polisacáridos del alga parda Dictyota dichotoma y su actividad antiviral

Abstract

Los objetivos iniciales de este trabajo de tesis consistieron en la extracción de los polisacáridos de la feofita Dictyota dichotoma, el fraccionamiento y la elucidación estructural de los polisacáridos purificados, y la evaluación de sus actividades antivirales contra los virus CVB3 y HHV1. El primer polisacárido extraído fue el fucoidano. El alga seca y molida se extrajo con etanol a temperatura ambiente y a 70 °C; seguidamente se extrajo con HCl diluido a temperatura ambiente y a 70 °C, por nueve veces consecutivamente. Sobre el residuo se extrajo el alginato con Na₂CO₃ al 3% a 50 °C. Los polisacáridos provenientes de la extracción con HCl se fraccionaron a través de la precipitación con Cetrimide y posterior redisolución con concentraciones crecientes de 0,5, 1, 1,5, 2, 4 y en algunos casos de 5 M de NaCl. El estudio estructural se basó en la metilación de los polisacáridos fraccionados y en la espectroscopía de resonancia magnética nuclear bidimensional, particularmente HSQC. Además, se realizaron análisis de las fracciones purificadas sobre los virus de CVB3 y HHV1. El fucoidano extraído a temperatura ambiente (EAR) mostró características de un polisacárido heterodisperso con respecto a la composición de monosacáridos, siendo la fucosa el principal monosacárido (36%), seguido de galactosa (23%), y proporciones más chicas de xilosa y manosa (≤ 18%). Además, dicho extracto mostró altas proporciones de hidratos de carbono (48%), ácidos urónicos (21%), medianas proporciones de grupos sulfato (15%) y un bajo peso molecular (6,5 KDa). Los extractos obtenidos a mayor temperatura también mostraron heterodispersión con respecto a la composición de monosacáridos, observando que conforme incrementaba la secuencia extractiva la cantidad de fucosa y galactosa disminuían, mientras que la cantidad de xilosa y manosa se incrementaban. Los análisis generales nos mostraron en todos los extractos altas proporciones de hidratos de carbono excepto en EAH9. Además, la cantidad de proteínas solubles y peso molecular y grupos sulfato disminuyeron, mientras que los ácidos urónicos incrementaban conforme se incrementaba la secuencia extractiva. El alginato extraído exhibió una preponderancia del ácido manurónico por sobre el ácido gulurónico. Además, los análisis mostraron que parecen triadas de dihos ácidos urónicos. El fraccionamiento con Cetrimide mostró que EAR y EAH1 tienen características de un típico galactofucano sulfatado, con cantidades muy pequeñas de otras estructuras. Conforme el fraccionamiento continúaba, a bajas redisoluciones, la cantidad de fucosa disminuía y la xilosa, manosa y ácidos urónicos se incrementaban. A medida que el fraccionamiento continúó esta tendencia predominó, la fucosa dejó de ser el monosacárido principal en la mayoría de las subfracciones en los siguientes extractos, mientras, que los manosa, xilosa y ácidos urónicos se incrementaron. El análisis estructural de las fracciones purificadas mostraron un core basado en residuos de →2)-Man-(1→ con sustituciones en O-3 o en O-6 y →6)-Gal-(1→, sulfatada en O-3. Además, se observó que los residuos de fucosa se encontraron enlazados en proporciones variables en C-2, C-3 y C-4, y en buena medida terminales, así como altas proporciones de ramificaciones de β-D-xilosa. La acción antiviral contra el virus HHV1 en las diferentes fracciones tanto a temperatura ambiente como a 70 °C, mostró que la fracciones -0,5, con características de uronofucoidanos, presentaron la más alta actividad antiviral, seguida de las fracciones EAR-2 y EAR-4. Por otro lado, a pesar que la actividad de las fracciones obtenidas a temperatura poseían menor actividad antiviral, las fracciones EAH2-0,5, EAH4-0,5 y EAH9-0 presentaron actividades moderadas. Con respecto al virus CVB3, los extractos de la feofita D. dichotoma mostraron actividades moderadas frente este virus, siendo las fracciones EAR-1,5, EAR-4 y EAH1-4, las que presentaron la mejor actividad antiviral. Cabe señalar que la fracción EAR-4, caracterizada por presentar un fucogalactano sulfatado, mostró ser la de mayor actividad frente a ambos virus, mientras que los altos valores obtenidos de CC₅₀ en todas las fracciones indican una baja citotoxicidad para los fucoidanos extraídos de Dictyota dichotoma.