La simbiosis fijadora de nitrógeno Sinorhizobium meliloti-alfalfa: aproximaciones ómicas aplicadas a la identificación y caracterización de determinantes genéticos del rizobio asociados a la colonización temprana de la raíz de alfalfa (Medicago sativa)

Abstract

Sinorhizobium meliloti es una α-proteobacteria capaz de establecer asociaciones simbióticas con plantas de los géneros Medicago, Melilotus y Trigonella. Esta asociación es el resultado de un complejo diálogo molecular entre los simbiontes, que se diferencian a lo largo de la interacción para dar lugar a un nuevo órgano en las raíces de las plantas, el nódulo fijador de nitrógeno. El nicho simbiótico accesible a los rizobios está naturalmente limitado, y resulta ocupado por aquellas cepas que muestran ser más competitivas para acceder al mismo. Las evidencias actuales indican que la competitividad para la nodulación es un fenómeno complejo, en el que son particularmente relevantes los procesos que tienen lugar en la vida rizosférica temprana. Lamentablemente, y a pesar del detallado conocimiento actual del proceso de infección y desarrollo de nódulos por los rizobios, muy poco se conoce sobre las etapas críticas de la colonización rizosférica. La caracterización molecular de las etapas tempranas de la simbiosis, donde el número de rizobios intervinientes es muy escaso, hace difícil el uso de aproximaciones transcriptómicas y proteómicas clásicas. En este marco nace el objetivo general de esta tesis, que utiliza dos alternativas experimentales aplicadas a la búsqueda y selección de determinantes genéticos de los rizobios asociados a la colonización temprana de la rizósfera y del rizoplano de alfalfa por Sinorhizobium meliloti. Por un lado hemos abordado la búsqueda de información sobre el conjunto de transcriptos específicamente inducidos en las etapas tempranas de la simbiosis, y para esto nos hemos enfocado en el mejoramiento de las herramientas disponibles para hacer estudios RIVET (Recombination based In Vivo Expression Technology). Dicha técnica utiliza una biblioteca de fusiones transcripcionales de todos los genes del microorganismo con el gen una recombinasa específica (tnpR sin promotor), cuya expresión será indicio de la actividad promotora del gen al que estaba fusionado la recombinasa y da como resultado la escisión (pérdida) de un cassette de ADN indicador presente en la misma bacteria en un lugar neutro de su genoma. Atento a la dificultad que significa la construcción de bibliotecas genómicas en vectores plasmídicos, en esta tesis hemos construido y validado una variante de módulo sensor que utiliza un transposón como herramienta para generar las fusiones trascripcionales, útil para estudios RIVET en diferentes gram-negativos y que representa una alternativa valiosa en reemplazo de la construcción de bibliotecas plasmídicas. En la segunda parte del trabajo de tesis hemos abordado la búsqueda y selección fenotípica de determinantes genéticos involucrados en las primeras etapas de la interacción simbiótica utilizando técnicas de mutagénesis etiquetada por firmas STM (Signature Tagged Mutagenesis). Esta metodología utiliza un conjunto de mutantes portadores de transposones mini-Tn5 etiquetados con una secuencia de nucleótidos que le es propia (firma) y que permite por tanto conocer la cantidad relativa de cada mutante en presencia de los otros. El desafío de un conjunto de mutantes a una condición de interés y la posterior evaluación de la proporción de cada firma al inicio y al final del experimento permite conocer que mutaciones redundan en efectos negativos y positivos sobre la condición estudiada. Hemos utilizado por primera vez la técnica de mutantes etiquetados asistida por plataformas de secuenciamiento de alta penetración para la evaluación del comportamiento de más de 6000 mutantes de S. meliloti en su capacidad de colonizar raíces de alfalfa y una leguminosa heteróloga (arveja). Los resultados alcanzados nos permitieron identificar más de un centenar de genes afectados en la colonización de raíces de alfalfa, algunos de los cuales resultaron específicos de la planta huésped. La identificación de las funciones asociadas a varios de esos genes nos ha permitido conocer actividades vinculadas a este proceso y proponer un modelo que explique las actividades requeridas para la colonización temprana del huésped.