Función y regulación de la glicerol-3-fosfato aciltransferasa 2 (GPAT2) en relación al crecimiento y diferenciación celular en su entorno fisiológico y patológico

Abstract

El primer paso y limitante, en la síntesis de novo de triacilglicéridos y glicerofosfolípidos está catalizado por la actividad de la glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) y consiste en la acilación del glicerol-3-fosfato con un acil-CoA de cadena larga para dar ácido lisofosfatídico (LPA). Hasta el momento se han descripto 4 isoformas en mamíferos para las GPATs (GPAT1-4) [EC 2.3.1.1]. Estas isoenzimas se diferencian por su ubicación subcelular (dos en la mitocondria (GPAT1 y 2) y dos en el retículo endoplásmico (GPAT3 y 4)) y tisular, su sensibilidad a sustancias reactivas a grupos –SH como la N-etilmaleimida (NEM) y por su preferencia de sustrato. Mientras que Gpat1, 3 y 4 se expresan en altos niveles en tejidos principalmente caracterizados por una alta tasa de síntesis y/o metabolismo de lípidos, como lo son el tejido adiposo, hígado y algunos tipos musculares, Gpat2 se expresa prácticamente de manera exclusiva en testículo. Además, la trascripción de este gen no se altera por el estado nutricional del animal ni tampoco aumenta en modelos de diferenciación celular de fibroblastos a adipocitos en cultivo. Recientemente, se ha descubierto que GPAT2 es de crucial importancia en la biogénesis de piRNAs y que esto es independiente de su actividad como aciltransferasa ya que esta función se mantiene aun cuando se muta el motivo que define dicha actividad. Los piRNAs son ARNs pequeños que se expresan predominantemente en células de la línea germinal, que son fundamentalmente conocidos por su papel en la protección del genoma, al silenciar elementos transponibles que se activan durante la desmetilación del ADN en las células germinales primordiales y cuyo nombre deriva de su asociación directa con proteínas PIWI (MILI, MIWI y MIWI2 en ratón). Patológicamente, GPAT2 se expresa además en ciertos tipos tumorales humanos. Por su patrón de expresión tisular, se había propuesto que Gpat2 forme parte de un grupo de genes llamados Antígenos Cáncer-Testículo (CTA), que refiere a genes o proteínas humanos y murinos que se expresan específicamente en tumores de distintos orígenes histológicos y en ningún otro tejido normal a excepción de las células germinales masculinas. Para muchos de ellos además, se sabe que cumplen funciones de importancia tanto en la espermatogénesis como en el desarrollo del fenotipo tumoral. A partir de estos hallazgos sumados al particular patrón de expresión tisular de GPAT2, se puede proponer que esta proteína fisiológicamente está cumpliendo otro rol de importancia, distinto al de aciltransferasa. Por lo tanto, para este trabajo de tesis doctoral nos planteamos como hipótesis que GPAT2 cumple un rol de importancia en la espermatogénesis y, como lo hacen otros CTA, influye en el desarrollo del fenotipo tumoral al sobreexpresarse ectópicamente en células cancerosas. Este patrón de expresión tisular específico está determinado principalmente por la regulación transcripcional del gen. Para corroborarla, nos planteamos los siguientes objetivos: 1. Estudiar la regulación transcripcional de Gpat2 de ratón, con el objetivo de determinar los principales mecanismos que influyen en su expresión en testículo. Se evaluaron la influencia de hormonas y de mecanismos epigenéticos. 2. Determinar la importancia de esta proteína en la espermatogénesis, para lo cual se silenció la expresión de Gpat2 en testículos de ratones prepúberes con la finalidad de disminuir la expresión de su producto y así determinar si GPAT2 es una proteína de importancia para el establecimiento de la capacidad reproductiva masculina. 3. Determinar si la presencia de GPAT2 influye en el desarrollo del fenotipo tumoral, para lo cual se emplearon líneas celulares humanas derivadas de tumores que expresan GPAT2 y cuyas características relacionadas con el fenotipo tumoral se evaluaron antes y después de silenciar la expresión de este gen. 4. Estudiar el patrón de expresión y regulación transcripcional de GPAT2 en líneas celulares humanas, para determinar cuáles son los mecanismos que influyen en la regulación transcripcional de este gen en humano para intentar explicar su expresión anómala en células tumorales y consolidar su pertenencia al grupo de los CTA. En base a los resultados obtenidos, podemos concluir que: 1. Gpat2 se expresa en espermatocitos en paquiteno y su perfil de expresión pre y posnatal en ratón coincide con el de Mili (una de las proteínas de la familia PIWI), lo que correlaciona y fortalece el hallazgo de que sea una proteína de importancia en la biogénesis de piRNAs. Este trabajo de tesis aportó información de importancia para validar la hipótesis de que GPAT2 cumple algún otro rol en el metabolismo celular que el de aciltransferasa, contribuyendo y enriqueciendo el descubrimiento de que esta isoforma sea importante en la biogénesis de los piRNAs. 2. La expresión de Gpat2 de ratón está regulada a nivel epigenético y por ácido retinoico. Tanto la presencia de RA, como la desacetilación de H y la desmetilación de su Isla CpG, aumentaron la expresión de Gpat2 in vitro e in vivo en el último caso. Varios trabajos han demostrado que estos mecanismos pueden actuar de forma coordinada para la regular la transcripción génica, por lo que se propone que Gpat2 esté regulado in vivo por la acción conjunta de estos procesos. 3. GPAT2 es una proteína de importancia en la espermatogénesis, ya que el silenciamiento de Gpat2 in vivo afecta al proceso espermatogénico. Una posible explicación para este hecho es que el silenciamiento de Gpat2 afecte la actividad conjunta con MILI, lo que alteraría la biogénesis de los piRNA de paquiteno. 4. La isoforma GPAT2 humana se expresa en altos niveles en líneas celulares humanas derivadas de tumor y en ciertos tipos de tumores humanos y su expresión influye en el desarrollo del fenotipo tumoral. Esto refuerza aún más la hipótesis de que esta proteína deba estar incluida dentro de la familia de CTA, ya que en general estos genes cumplen alguna función de importancia en el proceso de transformación tumoral. 5. Un mecanismo de importancia para explicar la expresión de GPAT2 en células tumorales es la hipometilación de la región circundante al primer exón. La principal causa de expresión ectópica de CTA en tejidos diferentes al testículo es el cambio en la metilación de las Islas CpG que se encuentren regulando la transcripción del gen. Por lo tanto, este hallazgo refuerza aún más la incorporación de GPAT2 al grupo de los CTAs y la vuelve una proteína interesante en clínica para el tratamiento inmunodirigido contra el cáncer.